冻干产品无菌工艺模拟试验方案改进及实施研究

1、引言

无菌工艺模拟试验是指采用微生物培养基替代无菌产品，对整个无菌生产工艺进行评估验证的技术，通常也被称为“培养基灌装试验”。需要把培养基灌装于无菌容器中，并在无菌生产环境中进行转运，通过模拟此无菌工艺的过程，最后将灌封有培养基的容器在适当温度下进行培养，检查容器内微生物的生长状况，来对无菌工艺模拟试验的结果进行评价，评价该试验是否在操作过程中产生了污染。通常将此试验应用于非最终灭菌的无菌产品中，而对最终灭菌产品没有强制的要求。根据《药品生产质量管理规范（2010年修订）》（GoodManufacturingPracticeofMedicalProducts，GMP）以及附录1的“无菌要求”，无菌产品的生产应当进行培养基灌装试验。在无菌生产过程当中，对于直接接触药物的设备、部件、灌装容器以及原料，虽然已经过灭菌，但是当采用这些要素进行无菌生产时，仍然会由于各种因素导致产品发生污染，从而影响了无菌产品的质量。因此，无菌工艺的评估应当采用一种更合适的方式进行。无菌工艺模拟试验，是对无菌工艺进行评估的一种验证技术，采用培养基模拟完成实际无菌生产操作后，可以对结果进行评价，借以确定实际生产中产品被污染的概率。Part2、无菌工艺模拟试验方案技术要求

广西梧州制药（集团）股份有限公司生产的无菌产品为冻干制剂，故以冻干产品的无菌工艺模拟试验来模拟整个工艺过程，包括从部件、材料的灭菌准备，一直到完成灌装和轧盖等整个过程。而对于无菌工艺模拟试验方案的设计中，工艺条件的选择应当选取合理的“最差条件”，即整个工艺流程，应采用最差条件来进行试验。最差条件即在工艺规程允许范围内，正常生产会遇到的最差情况，其并不包括由偏差引起的超出工艺要求的特殊情形。如果在最差条件下培养基灌装试验仍然取得好的结果，那么说明在比最差条件还要好的正常实际生产过程中，无菌保证水平会更有保证。2.1无菌工艺模拟试验最差条件设计

冻干产品的无菌工艺模拟试验最差条件设计，可以包括在准备阶段将物料、灌装器具、设备等按照工艺要求在无菌条件下放置允许的最长时间；灌装时可以在关键区域保留最多的人员；模拟在工艺允许范围内更长的灌装时间；控制无菌工艺模拟试验灌装速度等。2.2最差条件具体实施方式

2.2.1控制物料、器具、设备等放置时间冻干工艺所采用的西林瓶、胶塞、铝盖、灌装器具、配料系统和冻干柜，将其灭菌并放置工艺规程允许的最长时间后使用，如表1所示。表1包材、器具与设备灭菌后放置时间记录表其中，为了考察其放置最长时间后的无菌水平，西林瓶、胶塞和铝盖在放置结束后，均取样进行了无菌性检查，结果均符合无菌工艺要求，可继续用于无菌工艺模拟试验。2.2.2控制灌装人数参与无菌工艺模拟试验的关键区域人员，均按表2所示进行人员控制。进行无菌工艺模拟试验时，实际操作人员数量均按工艺规程允许的最大人员数量进行。其中，各洁净室组成人员，可由操作工、维修人员和检测人员组成，操作人员负责无菌模拟试验的生产操作，检测人员负责微生物取样、环境监控等操作，维修人员负责对设备进行模拟维修或突发情况的处理。表2培养基灌装试验人员控制记录表2.2.3灌装速度与时间控制在灌装运行速度上，基于风险评估，应对灌装速度进行评估并说明所定速度的理由。一般来说，对于广口的容器，可采用在无菌生产区暴露较长时间的工艺，即降低灌装速度，考察无菌过程是否受到污染；而对于瓶口较小的容器，可采用高速运行的方式来评估，在高速运行中进行大量手工操作干扰，用于评估无菌生产工艺是否受到污染。培养基灌装的持续时间控制是方案设计时必须考虑的重要问题，综合考虑生产操作、操作干扰和实际无菌操作的周期后，尽管最准确的方法是模拟全批量的操作时间，因为其最能反映实际生产运行的情况，但也可以有其他合理且适当的模式，预估模拟试验的时间一般不少于正常实际操作生产的时间，以更好地反映整个过程所带来污染的风险。Part3、试验先决条件检查

3.1厂房设施设备以及公用系统的准备

厂房设施设备以及公用系统的准备具体内容如下[1]。进行冻干产品无菌工艺模拟试验，需要确认工艺设备、公用系统和辅助设施都已经按照预期进行了相应的验证，且物品、厂房和设施所使用的消毒剂和消毒方式也完成了相应的验证。对于药液及产品所接触到的气体、设备组件、容器、器具灭菌工艺都应完成相应的验证，无菌生产区域的环境，应达到设计要求，能够持续稳定地运行。3.2人员的培训

参与无菌工艺模拟试验的人员，应接受药品GMP、无菌操作、微生物知识以及实施无菌模拟试验的相关培训，且进入无菌洁净区的全部人员，都应通过无菌更衣程序的确认，确认每位参与者可进入的区域以及其所允许的无菌操作项目。3.3培养基及相关包材的准备

进行无菌工艺模拟试验，应充分考虑模拟介质与无菌工艺的适宜性，应结合被模拟产品的特点以及模拟介质的可过滤性、澄清度、灭菌方式等方面来选择培养基，尽可能地模拟无菌生产工艺流程，且不应该选择具有抑菌性的模拟介质，以确认模拟试验的可信度。通常可以采用的培养基为胰酪胨大豆肉汤（TrypticSoytoneBroth，TSB），其无抑菌作用，且灭菌方式简单易操作；易溶解和扩散（若溶解性不好，悬浮在培养基中的模拟介质使培养基发生浑浊，容易影响结果的判断）；易清洁，对设备没有腐蚀性，对人体无害，不会对环境造成污染。培养基在使用前已进行除菌过滤，其灭菌方式应经过验证。无菌工艺模拟试验所用到的包装材料，应按相关质量标准检验合格，具备检验合格报告单。Part4、无菌工艺模拟试验方案的实施

4.1检测仪器与设备

ApexZ50激光尘埃粒子计数器、MAS-100NT浮游菌采样仪。4.2材料与试剂

TSB培养基、TSA培养基、培养皿（55mm、90mm）、西林瓶（7mL）、胶塞、铝盖。4.3无菌工艺模拟试验实施过程

冻干产品的无菌工艺模拟试验模拟的是整个工艺过程，包括培养基准备过程、灌装过程、冻干过程、轧盖过程和培养基微生物的培养过程，应在与实际生产相同条件下尽量模拟实际生产完成的相应操作，还应充分考虑生产时可能造成污染的各种因素，对各种干扰活动进行模拟，模拟无菌灌装期间遇到的最差状况下的操作。4.3.1培养基准备过程试验所使用的培养基应是经过微生物促生长能力检测合格的培养基，培养基（TSB）配制完成后，经除菌过滤至无菌储罐中，并在无菌储罐中贮存工艺允许的最长时间，贮存结束后，进行下一步的模拟灌装试验。4.3.2灌装过程灌装前，应按正常生产操作进行灌装部件的组装，并进行装量的调节。由于培养基灌装量较大（约9万支），且为瓶口较小的7mL西林瓶，故采用高速灌装，并在灌装过程中穿插干扰操作的模式来进行模拟，根据洗烘灌联动线的整体性能，把灌装速度控制在350支/min，灌装第2h和第4h，分别模拟一次灌装干扰操作，综合考虑生产操作、各种干扰和实际无菌操作的周期后，决定总灌装时长约为6h。4.3.3灌装干扰操作实施与改进在无菌工艺模拟试验过程中，必须模拟所有正常操作的活动，包括取样、称重、沉降菌换皿、层流车转运和产品出入冻干柜等，而除了这些计划的活动以外，还存在非计划却不可避免发生的活动，比如西林瓶倒瓶、爆瓶的处理，灌装异常的处理，各种灌装机故障维修等，因此本次无菌工艺模拟试验在进行所有正常操作的活动外，通过改进方案，需进行非正常的突发事件的处理来模拟最差生产状况[2]。表3可以作为本次无菌模拟试验干扰项目和频次的参考。4.3.4冻干过程灌装完的西林瓶运送至冻干柜内，关闭冻干柜门后，放置10h后，模拟抽真空补气操作2次（每次抽真空至500～600mbar），引发柜内空气流动，再通过无菌空气达到气流平衡。4.3.5轧盖过程冻干结束后，打开柜门摆放至少2h，西林瓶出柜，放置密闭车至少6h，然后进行轧盖，轧盖完成后，所有培养基产品全部制备完毕。4.3.6目检过程轧盖后的产品转移至目检操作间，人工进行目检检查。4.3.7微生物的培养已灌装的培养基应当在适当的条件下进行培养，以检出微生物，且培养温度应适宜于一般微生物及环境分离菌的恢复生长。（1）阴性对照。在模拟灌装过程中，抽取16支灌装并半加塞的培养基，进行压塞密封，作为阴性对照品，其中8支于30℃～35℃条件下培养14天，另8支于20℃～25℃条件下培养14天，其阴性对照不应出现浑浊。（2）阳性对照。为了确认培养基的促菌生长能力，在模拟灌装试验中，抽取25支灌装后半加塞的培养基，压塞密封，作为阳性对照品，其中5支接种金黄色葡萄球菌混悬液，5支接种铜绿假单胞菌混悬液，5支接种枯草杆菌混悬液，5支接种白色念珠菌混悬液，5支接种黑曲霉悬浮液，各菌种混悬液均为0.1mL，浓度＜100cfu/0.1mL。接种后，按药典规定进行菌种的培养。培养结束后，观察阳性对照品的生长情况，应被证实有菌生长则为合格。（3）试验样品的培养及调查。无菌工艺模拟试验的全部样品应当在适宜的温度条件下培养14天，先于较低温度（20℃～25℃）下培养至少7天，然后在较高温度（30℃～35℃）下培养至少7天，在低温和高温的培养过程中和培养结束后，分别观察一次，并记录检查结果，若发现污染应明确记录样品数量，若出现破损应记录并检查破损原因。由于灌装数量超过10000支，若出现1支污染，需进行调查；出现2支污染，需调查后进行再验证。培养基灌装的标准允许少量污染瓶的存在，但这绝对不是允许投放市场的无菌产品中可以存在受污染的状况，无菌工艺的目的就是防止污染，发现任何污染样品均应进行调查，分离到的污染微生物更应鉴别到种。若培养基灌装反复出现污染，即使每次都符合标准，也必须采取更严格的防污染措施[3]。4.3.8过程取样及环境监控无菌工艺模拟试验过程中，需对过程中的无菌包材进行取样，并对环境进行监控，以考察生产操作的实际情况，不应采取特别的生产控制和预防措施，制造特别良好的工艺环境，这样会导致不准确的评估结论，造成工艺条件良好的假想，过程取样及环境监控如表4所示。Part5、结束