微生物学实验教案

第一部分微生物学基本实验技术第一次实验（4学时，1人/组）显微镜技术绪言目的与规定：理解本学期《微生物学实验》的基本内容和实验须知事项。讲授：将本课程要开设的全部实验分板块进行简朴介绍，让学生有个基本理解；介绍微生物实验室应注意的某些问题（涉及生物安全、水电防火安全，实验前要预习、实验中要认真、统计要完整、实事求是等）和惯用器皿。第一次实验微生物的分离与接种（4学时，2人/组）实验一单位培养基的配备与灭菌、无菌器材的准备（P15-28）（3学时）一、实验目的与规定1.学习掌握培养基的配制原理，能根据不同的培养对象选用对应的培养基与培养条件。2.通过对牛肉膏蛋白胨细菌培养基的配制，掌握配制培养基的普通办法和环节。3.理解惯用灭菌办法的原理及其应用范畴。4.学习掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作技术。掌握无菌操作技术。5．纯熟准备无菌器材，为微生物的分离和纯化做好准备工作。二、实验器材溶液和试剂牛肉膏、蛋白胨，氯化钠，琼脂，1mol/LNaOH等。2.仪器和其它用品试管，三角瓶，烧杯，量筒，培养皿、玻棒，培养基分装器，天平，药勺，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸等。三、基本原理牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌天然培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有普通细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，因此可供作微生物生长繁殖之用。牛肉膏为微生物生长提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨提供氮源和维生素，氯化钠提供无机盐。琼脂是固化剂。配方：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，水1000ml，用稀酸或稀碱将pH值调到pH7.4-7.6。固体培养基普通加琼脂20g。高压蒸汽灭菌是将将待灭菌的物品放在一种密闭的加压容器内，通过加热使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。这种水蒸气能将锅内冷空气从排气阀中驱尽，然后在关闭排气阀的状况下继续加热，锅内蒸汽能增加锅内的压力，使沸点提高，得到高于100℃四、讲授重点1．培养基种类和配制培养基的基本原理。2．高压蒸汽灭菌的原理和规范操作流程。五、实验操作环节1．牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备（每组200ml）称量-溶化-调pH–定溶-分装-加塞-包扎-灭菌-搁置斜面或倒平板-无菌检查称量：按培养基配方比例依次称取牛肉膏0.6g、蛋白胨2g、氯化钠1g放入烧杯中。琼脂4g备用。溶化：量取200ml蒸馏水，加入少量至上述烧杯中，用玻璃棒搅拌，待药品溶解后，加入琼脂，倒入余下的水，在电热板上加热熔化调pH：待培养基稍冷却后，用精密pH试纸测量培养基的原始pH，若偏酸，用1mol/LNaOH边滴加边搅拌，使之达成pH7.4-7.6。若偏碱，则用1mol/LHCL调节。定溶：用量筒定溶到200ml。分装：用分装装置将培养基装入试管，高度为试管总长的1/5，每组6管。余下培养基转入三角瓶中，培养基的量为三角瓶容量的1/3-1/2。加塞：试管加棉花塞或泡沫塑料塞，三角瓶加盖棉塞或8层纱布。包扎：6支试管扎成一捆，棉塞外加一层牛皮纸或双层报纸防灭菌时冷凝水湿润棉塞，在外用麻绳扎成活结。三角瓶棉塞或纱布外加盖牛皮纸或双层报纸，用麻绳扎成活结。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。灭菌：见实验流程3搁置斜面：待灭菌的试管培养基冷却至50℃无菌检查：灭菌培养基放入37℃2．牛肉膏蛋白胨液体培养基的制备（1000ml/班）称取牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，倒入烧杯中，量取蒸馏水1000ml，先用少量水溶解药品，后加入余下的水，用稀酸或稀碱将pH值调到pH7.4-7.6。用分装装置将培养液分装到试管中，高度为试管长度的1/4。每组6管，自行分装、包扎、灭菌。3．准备无菌器材每组用报纸将8个培养皿包成一包，用报纸包1ml移液管5支、10ml移液管2支、玻璃涂布棒1根。每组捆扎加塞试管5支，每组用100ml三角烧瓶装入不超出三角瓶容积1/2的去离子水，加棉塞后，外加一层牛皮纸或双层报纸，麻绳扎成活结，用记号笔注明培养基名称、组别。3．高压蒸汽灭菌取出内层锅，向外层锅内注入适量的水，使水面与三角搁架相平；将用防水纸包扎好的物品放入灭菌器内层锅里，内层锅放回原位；加盖，并经两两对称方式同时旋紧相对的两个螺栓；接通电源，进行加热，全自动高压锅应关闭排气阀，手提式高压锅应打开排气阀，待排完冷空气后再关上排气阀。0.1MPa，121℃，维持20min；六、实验过程中的注意事项1.培养基的配制加热熔化过程中，要不停搅拌，以免琼脂或其它固体物质粘在烧杯底上烧焦。加热过程中所蒸发的水分应补足；pH值必须按不同培养基规定精确测定；全部器皿要清洁，忌用钢质、铁质器皿；分装培养基时，注意不使培养基沾在瓶口或管壁上端以免浸湿棉塞，引发杂菌污染；培养基灭菌的时间和温度，需按照多个培养基的规定进行，以达成灭菌效果且不损害必要营养成分；灭菌后的培养基须放37℃温箱内培养24小时，无细菌生长时方可使用。2.消毒和灭菌使用灭菌锅应严格按照操作程序进行，避免发生事故，如锅内应加足水份，以防干烧；灭菌时，操作者切勿私自离开；务必待压力下降到零后，才可打开锅盖；干热灭菌时电烘箱中物品不要摆得太拥挤，以免妨碍空气流通而影响灭菌效果；灭菌物品不要与电烘箱内壁的铁板接触，以防包装纸烤焦起火。七、思考题1．固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？培养基中加琼脂的作用是什么？2．培养基配好后，为什么必须立刻灭菌？如何检查培养基灭菌与否彻底？3．高压蒸汽灭菌开始前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降至0时才干打开排气阀，开盖取物？八、实验操作考核点操作与否规范实验二微生物的分离与接种及无菌操作技术一、实验目的与规定1.体会无菌操作技术在微生物研究中的重要性。2.掌握倒平板的办法，掌握惯用微生物转接的无菌操作技术。3．理解几个惯用的微生物接种办法，用稀释涂布法或平板划线法进行微生物分离时，能获得单菌落。二、实验器材1．菌种：大肠杆菌（Escherichiacoli）培养平板或斜面培养物培养基牛肉膏蛋白胨固体和液体培养基。3.仪器和其它用品接种环、酒精灯、试管架、记号笔、培养皿、恒温培养箱等。三、基本原理高温对微生物含有致死效应，在微生物接种时，普通在酒精灯旁进行，用火焰直接灼烧接种环，以达成灭菌的目的。自然界中多个微生物混杂生活在一起，即使取极少量的样品也是许多微生物共存的群体，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处在纯培养状态。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分离法惯用的有：稀释涂布平板法、稀释混合平板法与平板划线法。不同的微生物在固体、半固体和液体培养基中能体现出各自特有的培养特性，这些特性能够作为不同种类微生物的鉴别特性之一。四、讲授重点1．倒平板2．微生物转接办法3．平板划线法和涂布平板法五、实验操作环节1．试管斜面和液体培养基接种技术（无菌操作技术）A、试管斜面接种法（用接种环转接菌种）：标记–取菌–接种–培养标记：用记号笔看待接试管斜面培养基进行标记，写上待接菌种名称、接种日期、组别。取菌：左手拿大肠杆菌试管斜面培养物，右手持接种环，将接种环在火焰上进行灼烧灭菌，然后在火焰旁用右手小指指和无名指或右手掌缘拔出并夹住试管棉塞，试管口在火焰上烧一下。接种环轻轻插入斜面上半部，在管壁冷却水上或管壁上使接种环冷后，挑起少量菌苔，再烧一下试管口，塞上棉塞，左手把斜面试管放回试管架。右手持有菌接种环在酒精灯旁无菌区。接种：左手从试管架上取出标记好的斜面试管一支，右手掌缘拔出棉塞，试管口在酒精灯上灼烧一下，沾有菌苔的接种环快速放进斜面底部，从下到上划始终线，然后再从底部开始向上作蛇形划线接种。完毕后，烧一下试管口，塞上棉塞，接种环在火焰上灼烧后放回原处。培养：试管放37℃B．液体培养基接种法：接种流程同A。接种时略有不同，即将挑有菌苔的接种环在液体表面的管内壁上轻轻摩擦，使菌体分散从环上脱开，进入液体培养基中。轻轻摇匀培养液。2．平板分离技术A．稀释涂布平板法：倒平板–菌液稀释–涂布–培养–挑单菌落倒平板：灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基冷却到55℃左右，摇匀。解开麻绳，去掉三角瓶口上的牛皮纸和纱布，右手持装培养基的三角瓶在酒灯旁，瓶口对着火焰。左手持9cm菌液稀释：取5支无菌试管，每管加9ml无菌水，无菌操作取1ml大肠杆菌菌液至9ml无菌水中混匀，依次进行10倍稀释。涂布：取0.1ml稀释菌液入平板中，用无菌涂布棒在培养基表面涂布均匀。培养：合上皿盖，倒置培养皿于37℃挑菌落：挑取单个菌落的菌苔少量，涂在载玻片上进行显微镜个体形态观察，结合菌落形态特性综合分析。若不纯，需再用平板分离法进行纯化。B．平板划线法：倒平板–划线–培养–挑单菌落。倒平板、培养和挑单菌落同A。划线：左手拿平板，右手拿接种环在火焰上灭菌后沾取菌液或菌苔一环，在平板上划平行线三条，接种环在火焰上灭菌，左手转动平皿约70度，用无菌接种环通过第一次划线的末端作为起点作二次划线，依次作第三次、第四次划线（平行线划线法）。或将挑取有菌的接种环在平板培养基上作持续划线。六、实验过程中的注意事项1．无菌接种技术无菌操作需在火焰旁进行，手不可触摸试管口端，以防烫伤；接种时接种环不要碰触试管口边，避免污染；棉塞不可放在桌面上，应当用右手手缘或右手指间夹住。2．平板分离技术倒平板时，培养皿边沿不要沾染培养基，摇匀培养基时要轻，以防培养液溅到皿盖或溢出培养皿；划线接种时，动作要轻，注意不要划破培养基；分离、接种时应严格按无菌操作规定进行；平板培养微生物时一定要倒置培养。七、实验成果1．统计液体培养基和固体斜面培养基上，细菌的生长状况。2．统计菌种分离培养的成果。八、实验操作考核点1．无菌操作2．平板划线办法与否对的第二次实验（4学时，1人/组）实验三普通光学显微镜的使用及微生物形态观察（P40-47）一、实验目的和规定1．理解普通光学显微镜的构造及各部分的功效。2．学习并掌握油镜的原理和使用办法、维护的基本知识。3．掌握运用显微镜观察不同微生物的基本技能。4．理解细菌、放线菌、酵母、霉菌在显微镜下的基本形态特性。二、实验器材菌种：细菌、放线菌、酵母和霉菌的染色玻片标本（每种最少一片/组）。溶液和试剂：香柏油、乙醇乙醚混合液或二甲苯等（各一瓶/组）。仪器或其它用品：普通光学显微镜（1台/组）、擦镜纸。三、基本原理当代普通光学显微镜运用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分构成，在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为核心，它直接影响着显微镜的分辨率，而在普通光学显微镜普通配制的几个物镜中，油镜的放大倍数最高，但需要在载波片与镜头之间加滴镜油，重要是为了增加照明亮度和提高显微镜的分辨率。物镜放大倍数越大，焦距越短，直径更小，所需光强越大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同，会发生折射或全反射使光线不能进入镜头。成果造成物像不清。在油镜和玻片间滴加与玻璃折射率（空气是1.55，香柏油是1.52）相近的镜油，使光线不会造成太大的损失。显微镜分辩率是显微镜能分辨两点之间的最小距离的能力，最小距离越小，分辨率越高。分辩率=λ/2NA=λ/2n·sin（α/2）公式中λ可见光波长，平均为0.55μm，n折射率(香柏油1.52，空气1.0，水1.33)，NA是物镜的数值孔径，取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率。四、讲授重点1.显微镜构造2.油镜工作原理3．如何使用双目清晰观察物像4．聚光器数值孔径的调节5．运用物镜的同焦现象，如何配合使用低倍镜、高倍镜和油镜分别在不同物镜下获得清晰图像。6．数码显微镜拍照软件的使用五、实验操作环节（一）显微镜操作观察前准备：镜座距实验台边沿约10cm，光源调节，调节目镜、调节聚光器数值孔径值。显微镜观察：一种办法是先低倍再高倍再油镜，使用微调节器聚焦。第二种办法是在低倍下找到样品区，用粗调节器升高镜筒，将油镜转到工作位置，在样品区滴加镜油后，从侧面注视用粗调节器小心降下镜筒，并使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接，调节聚光器的数值孔径及视野照明亮度后，用粗调节器将镜筒渐渐上升，再用细调节器使聚焦清晰为止。后一种办法尽量不用，在实验中重点介绍和使用第一种办法。显微镜用毕后的解决：上升镜筒，取下载玻片；擦净镜油；清洁物镜及目镜；还原各部件，降下聚光镜。（二）数码显微镜软件Motic六、实验过程中的注意事项1．显微镜是精密仪器，在取放时要一手托住底座，一手握住镜臂，忌用单手拎提。2．养成双目观察的习惯，忌单眼观察。3．观察时可摘下近视镜或远视镜，因显微镜含有聚焦校正功效。若在观察时配载眼镜，应避免眼镜镜片与目镜镜片接触，以免造成镜片划痕。4．显微镜照明亮度的调节，可通过升降聚光器或变化光源亮度进行调节，普通状况下聚光器都是调到最高位置。只要能获得良好的观察效果，也能够通过对虹彩光圈、聚光器高度、照明光源强度的协同调节灵活运用。5．使用粗节器聚焦物像时，必须养成的习惯是：先从侧面注视并小心调节物镜靠近标本，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本。否则可能因误操作而损坏镜头及玻片。6．普通状况下，可运用同焦现象，对在低倍镜下看到的物像，能够转动物镜转换器将其它物镜转到工作位置，然后用细调节器对物像进行清晰聚焦，能够避免因使用粗调节器时可能发生的误操作而损害镜头或玻片。7．使用乙醇乙醚混和物或二甲笨等清洁剂时，不要过量使用或让其在镜头上停留时间过长，因清洁剂对镜头会造成损害。不能用手或滤纸擦镜头，以免污染镜头或产生划痕。8．注意分辨待观察样品与使用时间较长的显微镜镜头上的霉点等污物。9．每人在D盘上建一种文献夹，以班级加名字作文献夹名，将图片放在其中。每个图片文献采用JPEG格式，以学生名字、菌种属名和总放大倍数作为文献名。七、实验成果用数码显微镜软件分别拍摄你在低倍或高倍物镜下所观察到的放线菌、酵母菌和真菌的形态图及在油镜下所观察到的细菌形态图，制成图版打印黑白图片，并标注菌种名称、观察物镜及总放大倍数。注意：每人需在低倍或高倍物镜下观察放线菌、酵母和霉菌，在油镜下观察细菌，每一类型的微生物最少观察一种标本片。八、思考题1．用油镜观察时应注意哪些问题？2．在载玻片和镜头之间滴加香柏油有什么作用？九、本实验的实验操作考核点油镜下的物像清晰度实验四细菌制片与简朴染色法（P69-84）一、实验目的和规定1.学习并掌握细菌涂片、简朴染色的基本技术。2．初步理解无菌操作技术，巩固显微镜(油镜)操作办法。二、实验器材1．菌种：大肠杆菌（Escherichiacoli），枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），金黄色葡萄球菌（Saphylococcusaureus）斜面培养物。2.染色剂：碱性美蓝染液，石炭酸复红染液。3.仪器或其它用品：显微镜，酒精灯，载玻片，镊子、接种环、载玻片夹子、滤纸等。三、基本原理细菌制片常采用涂片法，通过涂沫能使细菌细胞个体均匀分散在载玻片上，有助于观察个体形态。加热固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，能杀死大多数细菌但不会破坏细胞形态。微生物染色的基本原理是借助物理和化学因素的作用而进行的。物理因素：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗入和吸附作用等。化学因素：重要是正负离子之间的互相吸引。染色剂按染料电离后所在地带电荷的性质分为几个类型：酸性染料（如酸性复红，刚果红，伊红和苯胺黑等）、碱性染料（碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰等，细菌易被这种染料染色）、中性（复合）染性（伊红，美兰，Gimsa染料）。简朴染色法是运用单一染料（如吕氏美蓝、碱性品红）对细菌进行染色的一种办法，合用于菌体普通形状和细菌排列的观察。在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞普通带负电荷，碱性染料电离时的染色部分带正电荷，因此，碱性染料的染色部分容易与细菌结合使细菌着色。在显微镜下因与背景有明显对比而易于识别。四、讲授重点1.细菌简朴染色的原理。2.无菌操作与细菌涂片操作要点。3.染色剂的类型与惯用种类。4．显微镜的的使用。五、实验操作环节涂片-干燥-固定–染色–水洗–干燥-镜检1．涂片：取干净载玻片，用记号笔做好标记，滴一滴生理盐水于载玻片中央；用接种环无菌操作分别挑取适量菌苔，沾有菌苔的接种环在载玻片上的生理盐水中涂抹，使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜（如果用液体培养物，则用接种环蘸取1-2环菌液直接涂沫于载玻片上）。2．干燥：自然风干或用电吹风干燥。3．固定：细菌涂面朝上，通过火焰2-3次。4．染色：载玻片平放于桌面或载玻片支架上，滴加染液使之覆盖菌膜，普通染色1-2分钟。5．水洗：倾去染液，用自来水冲洗，水流宜缓，否则易冲掉细菌涂膜，至洗出的水无色为止。6．干燥：用吸水纸吸去多出水分，自然风干。7．镜检：制好的样片在显微镜下观察并统计。六、注意事项1．涂片时取菌量要适量，且规定涂布均匀。2．无菌操作取菌时一定要等接种环冷却后再取菌，以免高温使菌体变形。3．涂片需干燥后再加热固定，避免加热时间过长引发细胞易破裂或变形，以至载玻片破裂。加热固定时要用载玻片夹子或镊子，以免烫伤。4．使用染料时注意避免沾到衣物和实验台面上。七、实验成果拍摄在油镜下观察到的细菌形态图，标明菌种名称和总放大倍数。注意：每人最少用一种染色剂对一种菌种进行染色、观察和统计实验成果。八、思考题在进行细菌涂片时应注意哪些环节？为什么规定制片完全干燥后才干用油镜观察？九、实验操作考核点1．涂片质量2．油镜下图像的清晰度实验五细菌革兰氏染色法一、实验目的和规定1.理解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。2．掌握革兰氏染色法操作技术。二、实验器材菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），大肠杆菌（Escherichiacoli），金黄色葡萄球菌（Saphylococcusaureus）等细菌斜面培养物。2.染色剂：石炭酸复红染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%乙醇。3.仪器或其它用品：显微镜，酒精灯，载玻片，镊子、接种环、载玻片夹子、滤纸等。三、基本原理革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和阴性，是由这两类细菌细胞壁的构造和构成不同决定的，当用脱色剂解决时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁重要由肽聚糖形成的网状构造构成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状构造孔径缩小，通透性减少，从而使结晶紫－碘复合物不易被洗脱而保存在细胞内，经脱色和复染后仍保存初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，因此当脱色解决时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫－碘的复合物比较容易洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。革兰氏染色是细菌分类的重要根据之一。四、讲授重点1.细菌革兰氏染色的原理。2.革兰氏染色操作要点和成果判断。五、实验操作环节制片-初染-媒染-脱色-复染-镜检-混合涂片染色1．制片：与细菌简朴染色法的涂片、干燥和固定过程相似。2．初染：滴加结晶紫染色液于菌膜上1-2分钟，流水冲洗。3．媒染：卢戈氏碘液冲洗一下菌膜，再滴加该液于菌膜上，静置1分钟。4．脱色：95%酒精冲洗至无色后，再水洗。5．复染：番红染色液覆盖菌膜，静置2分钟后水洗，干燥。6．镜检：显微镜观察。7．混合涂片染色：在熟悉上述革兰氏染色过程后，在同一载玻片上用枯草芽孢杆菌与大肠杆菌或大肠杆菌与与金黄色葡萄球菌作混合涂片，染色、镜检比较观察。六、实验注意事项1．实验二中的注意事项同样合用于本实验。2．选用活跃生长久菌种、涂片厚度适宜、脱色程度适宜，能避免产生假性革兰氏染色成果。七、实验成果1．拍摄油镜下观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌或枯草芽孢杆菌与大肠杆菌的单菌涂片及混合涂片的革兰氏染色菌体图。2．将实验成果填于表2-1。表2-1革兰氏染色成果统计表菌名菌体颜色细菌形态成果（G+、G-）八．思考题1．在进行细菌涂片时应注意哪些环节？为什么规定制片完全干燥后才干用油镜观察？2．革兰氏染色能否成功，有哪些问题需要注意，为什么？你认为革兰氏染色法中哪个环节能够省略？在何种状况下能够省略？九、本实验操作部分考核点1．无菌操作2．染色过程操作与否规范3．显微镜操作实验六细菌芽胞染色法一、实验目的和规定1.学习并掌握芽孢染色法的原理和技术，理解芽孢的形态特性。2.巩固显微镜(油镜)操作办法。实验器材1.菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）斜面培养物。2.染色剂：石炭酸复红染液，5%孔雀绿水溶液。3.仪器或其它用品：显微镜，酒精灯，载玻片，镊子、接种环、载玻片夹子、滤纸等。三、基本原理芽孢是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，普通是圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢及芽孢的形状、在芽孢囊内的位置、芽孢囊与否膨大等特性是鉴定细菌的根据之一。因芽孢壁厚、透性低、不易着色，但一旦着色也很难脱去。当用着色力强的染色剂（如孔雀绿、石炭酸复红）在加热条件下染色时，染料可进入菌体和芽孢内，但菌体内的染料经水洗可脱掉，芽孢内的染料仍然存在呈色。用对比度大的复染剂染色时，芽孢保存初染剂的颜色，菌体和芽孢囊呈现复染剂的颜色。四、讲授重点1.芽孢染色原理和Schaeffer-Fulton氏染色办法。2.细菌芽孢的形态。五、实验操作环节Schaeffer-Fulton氏染色法：1．制片：涂片、干燥、固定。2．染色：5%孔雀绿滴在涂片上，夹子夹住玻片一端，在微火上加热至染料冒蒸气开始计时5分钟。3．水洗：待玻片冷却后用流水冲洗至流出的水为无色。4．复染：番红染液复染2分钟，水洗，干燥。5．镜检六、实验注意事项1．实验二的注意事项合用于本实验。2．选用适宜菌龄的菌种进行芽孢染色，幼龄菌尚未产生芽孢，老龄菌芽孢囊已破裂，不易获得对的染色成果。3．加热时间和温度要适宜，否则芽胞不易着色或温度过高造成菌体或芽孢囊破裂。4．在将孔雀石绿染液加热时切不可蒸干。5．脱色时必须等玻璃片冷却后再进行，否则冷水冲洗易造成玻片破裂。6．注意安全，谨防烫伤和使用酒精灯时可能引发的火灾。七、实验成果绘图并阐明枯草芽孢杆菌的形态特性。八、思考题为什么芽孢染色需要进行加热？能否用简朴染色法观察到细菌芽孢？九、实验操作考核要点1．染色成果与否对的2．涂片质量3．显微镜操作第三次实验微生物个体形态和群体形态观察（P69-76）（4学时，1人/组）实验六放线菌个体形态和菌落形态观察一、实验目的和规定1.学习并掌握放线菌几个制片办法和简朴染色的基本技术。2.掌握放线菌个体细胞和菌落的形态特性，并注意与霉菌、酵母菌的互相区别。二、实验器材1．菌种：放线链霉菌（Streptomycessp.)插片平板培养物。2．染色剂：吕氏碱性美蓝染液，石炭酸复红染色液。3．仪器和其它用品：显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、滤纸片、接种环、接种铲、镊子等。三、基本原理放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌，常见放线菌大多能形成菌丝体。紧贴培养基表面或进一步培养基生长的叫营养菌丝（基内菌丝，较透明较细），其生长到一定阶段能向空气中生长，叫气生菌丝（较粗，色较暗），由气生菌丝分化形成孢子丝及孢子。孢子丝成螺旋形、波浪形或分枝状等，孢子常呈圆形、椭圆形或杆形。气生菌丝、孢子丝和孢子的形态、颜色常作为放线菌分类的重要根据。制片时普通采用插片法并结合简朴染色进行观察，也能够用印片法将放线菌菌落或菌苔表面的孢子丝印在载玻片上，经简朴染色后观察。放线菌菌落干燥、不透明、表面呈致密的丝绒状，上有一薄层“干粉”。酵母菌是一类呈单细胞生长的真核微生物的总称，少数能形成假菌丝。酵母菌的菌落较湿润，与细菌菌落较相似，但不透明。四、讲授重点1．放线菌个体和菌落的普通形态特性。2．插片法观察放线菌个体形态的办法和操作要点。五、实验操作环节（一）插片染色法1．取盖片：取出放线链霉菌插片平板培养物，用镊子轻取盖片，擦去背面培养物。2．固定：用酒精灯微热固定。3．染色：用碱性美蓝染液或石炭酸复红染色液染色1-2分钟。4．水洗、干燥5．观察：菌面朝上置于载片上，镜检观察。（二）菌落形态观察对放线菌琼脂平板上的菌落进行认真观察，统计菌落大小、形状、透明程度、颜色、表面干燥或湿润，能否易挑取等特性。六、实验过程中的注意事项1．放线菌插片法操作过程中，在移动附着有菌体的盖玻片时勿碰动菌丝体，菌面需朝上，以免破坏菌丝体的形态。2．印片过程中，用力要轻，两块载玻片不能错动。3．水洗时水流要缓，以免破坏孢子丝的形态。4．插片法观察个体形态时，宜用微调节器分别聚焦，方便清晰观察到处在不同焦平面上的孢子、孢子丝、气生菌丝和基内菌丝。5．观察菌落时，注意正反两面的颜色和菌落表面的薄层“干粉”，认真分辨与霉菌菌落的异同点。不要随意移动开盖，以免孢子飞散污染实验室。七、实验成果绘图并阐明所观察到的放线菌的形态特性。八、思考题镜检时如何分辨基内菌丝、气生菌丝和孢子丝？九、实验操作考核点1．能否分辨放线菌的基内菌丝、气生菌丝、孢子丝和孢子。实验七酵母菌个体形态、菌落形态观察及死活细胞鉴定一、实验目的和规定1.学习并掌握酵母菌死活细胞鉴定的原理和基本操作技术。2.理解酵母菌的个体和菌落形态特性，及其与细菌的区别。二、实验器材1．菌种：酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）的平板培养物。（提供空气中细菌培养平板，用于酵母和细菌菌落形态的比较观察）。2．染色剂：吕氏碱性美蓝染液，石炭酸复红。3．仪器和其它用品：显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、滤纸片、接种环、镊子等。三、基本原理酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，少数能形成假菌丝，普通比常见细菌大几倍甚至十几倍。大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内含有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，故含有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色。酵母菌的菌落较湿润，与细菌菌落较相似，但不透明，有特殊的酒香味。四、讲授重点1．酵母死活细胞鉴定原理。2．酵母细胞的个体形态，注意出芽繁殖方式是其重要特点。3．如何分辨酵母与细菌菌落。五、操作环节1．酵母个体形态及死活细胞观察在载玻片上滴加1小滴生理盐水，用接种环挑取少量菌苔，涂布均匀-在载玻片中央滴加1小滴吕氏碱性美蓝染色液（0.1%）混合均匀-盖上盖玻片-放置3分钟-先低倍后高倍镜下观察酵母形态和出芽状况-30分钟后再观察。并根据颜色来区别死活细胞，蓝色细胞是死细胞，无色细胞是活细胞。2．菌落形态观察：认真观察酵母菌菌落，统计菌落大小、形状、透明程度、颜色、表面干燥或湿润，能否易挑取等特性，注意与细菌菌落的区别。六、实验过程中的注意事项1．酵母菌制片时，当菌体与染液混合时注意不要激烈涂沫，以免破坏细胞。2．生理盐水和染液滴加量均要适中，盖盖玻片时，染液过多易溢出，过少易产愤怒泡。盖玻片缓慢倾斜覆盖，能避免产愤怒泡。3．观察菌落特点时，注意其表面与否湿润、大小和形态，注意与细菌菌落的区别。七、实验成果1．绘图阐明显微镜下所观察到的酵母菌的形态特性。2．根据你所观察到的吕氏美蓝染液作用时间与酿酒酵母死、活细胞数量变化的状况，填写表3-1。表3-1酵母染色成果统计表吕氏美蓝浓度0.1%作用时间3min30min每视野活细胞数（个）每视野活细胞数（个）八、思考题酿酒酵母通过出芽方式进行无性繁殖，也能形成子囊孢子进行有性繁殖，你在这实验过程中与否观察到酿酒酵母的子囊孢子？如果没有，请分析因素。九、实验操作考核点1．无菌操作2．制片3．显微镜操作实验八霉菌的个体形态和菌落形态观察一、实验目的和规定1.学习并掌握霉菌直接制片制片技术。2.理解四类常见霉菌（青霉、曲霉、毛霉、根霉）形态特性和互相区别。3.理解霉菌菌落形态特性及其与放线菌、酵母菌和细菌菌落的互相区别。二、实验器材1．菌种：青霉（Penicilliunsp.）、曲霉(Aspergillusniger)、根霉(Rhizopussp.)的平板培养物。2．染色剂：吕氏碱性美蓝染液或石炭酸复红染色液。3．仪器和其它用品：显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、滤纸片纸、解剖针、镊子、生理盐水等。三、基本原理霉菌可产生复杂分枝的菌丝体，分为基生菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段后分化产生繁殖菌丝