常用细胞培养技术 传代1原代培养细胞的首次传代

2023/10/271原代培养细胞首次传代

2023/10/2722023/10/27一、原代培养细胞的首次传代悬浮细胞：增殖，数量增加甚至达饱和密度；贴壁细胞：相互汇合，覆盖整个瓶底；=〉细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养使细胞分散接种的过程称之为传代。传代原因：1、细胞与培养基的接触面减少，造成营养不足；2、生长的密度抑制。2023/10/2732023/10/2742023/10/27贴壁细胞的消化传代步骤(1)吸除旧培养基(2)加2mLPBS（无钙、镁），漂洗一次(3)加1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液）(4)轻摇培养瓶，消化液铺满细胞表面2023/10/2752023/10/27(4)

镜下见细胞回缩，细胞间隙增大，倒掉消化液，再继续作用2～3分钟。(5)镜下见变圆，立即终止消化。(6)加完全培养基，反复吹打；吹打按顺序进行，确保所有瓶壁均吹到吹打要轻柔，不要出现泡沫，避免机械损伤(7)

计数，调整浓度，分瓶培养。2023/10/2762023/10/27首次传代应注意以下几点：(1)密度不高，不能传代，〉80%(2)控制消化时间。多种细胞混杂，不同细胞消化时间不同。(3)吹打轻，减少机械损伤。(4)接种量多一些，使尽快适应环境，生长和繁殖。(5)pH应偏低些，血清浓度加大至15%～20%。2023/10/2772023/10/27125二、细胞系的维持细胞系的维持通过换液、传代、再换液、再传代和细胞冻存实现。细胞系的维持要注意以下几点：每个细胞系做好档案，包括组织来源、生物学特性、培养特点（培养液、换液、传代时间……)、生长形态、遗传学特点……。换液、传代按自身规律进行。防止细胞系间交叉污染。细胞系传代次数较少时，做好充足冻存贮备。做好细胞系（或株）的鉴定和管理工作。2023/10/2782023/10/2792023/10/27三、原代细胞的纯化和克隆原代细胞绝大多数混合生长为了保证实验结果的可靠性、一致性、稳定性和可重复性；采用单一种类细胞实验；因而纯化就成为实验研究的重要一步。2023/10/27102023/10/27纯化方法(一)自然纯化：传代过程中自然淘汰法生长优势旺排挤生长慢的细胞最后留下优势旺细胞。如肿瘤突变细胞通过此方法建立细胞系。缺点：耗时长；最后剩下的不一定是所需细胞，通常是成纤维细胞，少部分是恶性肿瘤细胞。(二)人工纯化：利用人为手段造成有利某一细胞生长环境，抑制其他细胞生长。主要有以下5种方法：2023/10/27112023/10/271.培养基限定法：细胞生长过程中，必须存在或去除某种物质，否则无法生长，而其他细胞与之相反。例如加入特殊的细胞因子而纯化出只依赖于这种细胞因子生长的细胞系。2.酶消化法：上皮细胞对胰蛋白酶的耐受性高；成纤维细胞对胰蛋白酶的敏感---耐受性低；使两者分开，达到纯化的目的。2023/10/27122023/10/273.机械刮除法原代培养时，上皮细胞和成纤维细胞为分区成片生长，机械方法去除不需要的细胞区域而保留需要的细胞区域。方法：显微镜下，用专用细胞刮刮掉，冲洗2次后，继续培养。多次后达纯化目的。2023/10/27132023/10/274.反复贴壁法成纤维细胞：贴壁快（10-30min）；上皮细胞：短时间不能附着或附着不稳定，稍振荡即浮起据此纯化细胞。方法：镜下观察，部分细胞贴壁后摇荡培养基，倒掉反复多次，达到去除上皮细胞的目的。2023/10/27142023/10/275.克隆法稀释细胞，使单个细胞在体外增殖6代以上，形成的细胞群称作克隆。每个克隆含50个以上细胞，一个克隆起源一个细胞，达到纯化目的。使细胞遗传学和生物学特性更相似，利于实验研究。6.流式细胞仪分离法可根据细胞物质含量、结构和大小等达到分离细胞的目的。

2023/10/27152023/10/27细胞传代方法传代细胞，不同细胞采取不同的传代方法。贴壁生长的细胞：消化法传代；部分贴壁的细胞：直接吹打或用硅胶软刮的刮除法传代。悬浮细胞：加入等量新鲜培养基后直接吹打分散传代自然沉降，加入新培养基后再吹打分散传代。2023/10/27162023/10/27贴壁细胞的消化传代步骤(1)吸除旧培养基(2)加2mLPBS（无钙、镁），漂洗一次(3)加1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液）(4)轻摇培养瓶，消化液铺满细胞表面2023/10/27172023/10/27(4)

镜下见细胞回缩，