发酵工程应用实例 柠檬酸发酵

柠檬酸发酵柠檬酸又称枸橼酸，化学名称2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸。根据其含水量的不同，分为一水柠檬酸和无水柠檬酸。柠檬酸的用途非常广泛,用于食品工业占生产量的75%以上,可做为食品的酸味剂,抗氧化剂,pH调节剂,用于清凉饮料、果酱、水果和糕点等食品中。用于医药工业占10%左右,主要用作抗凝血剂、解酸药、矫味剂、化妆品等。用于化学工业等占15%左右,用作缓冲剂、络合剂、金属清洗剂、媒染剂、胶凝剂、调色剂等。在电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域中都有十分广阔。天然柠檬酸在自然界中分布很广，天然的柠檬酸存在于植物如柠檬、柑橘、菠萝等果实和动物的骨骼、肌肉、血液中。人工合成的柠檬酸是用砂糖、糖蜜、淀粉、葡萄等含糖物质发酵而制得的，可分为无水和水合物两种。纯品柠檬酸为无色透明结晶或白色粉末，无臭，有一种诱人的酸味。

柠檬酸发酵典型工艺

1、试管斜面菌种培养

察氏琼脂培养基：NaNO3

3g，

蔗糖20g，

K2HPO4

1g，

KCl

0.5g，

MgSO4.7

H2O

0.5g，

FeSO4

0.01g，

琼脂20g，

用水定溶至1000ml，

pH自然。

察氏-多氏琼脂培养基：蔗糖30g，NaNO3

2g，

MgSO4.7H2O

0.5g，

KH2PO4

1g，

KCl

0.5g，

FeSO4.7H2O

0.01g，

溴甲分绿0.4g，琼脂20g，

蒸馏水1000ml，

pH自然。1、试管斜面菌种培养

蔗糖合成琼脂培养基：蔗糖140g，

NH4NO3

2g，

KH2PO4

2g，

MgSO4.7H2O

0.25g，

FeCl3.6H2O

0.02g，

MnSO4.4H2O

0.02g，

麦芽汁20ml，

琼脂20g，

用水定溶至1000ml。

米曲汁琼脂培养基：一份米曲加四倍质量的水，于55℃保温糖化3~4小时后煮沸，滤液用水调整浓度至10‘Bx，并用碱液将pH调制到6.0，接着添加琼脂2%。确认所制成的斜面无杂菌污染后，接入黑曲霉孢子悬液0.1ml，于32℃培养4~5d。2、

种子扩大培养

①

二级扩大培养a

培养基

有琼脂固体培养和液体表面培养两种方法，前者的培养基组成与斜面培养基相同，后者的组成如下：麦芽汁7˚BX，氯化铵2%，尿素0.1%

b

培养

固体培养时，500ml茄子瓶装80ml琼脂培养基，250ml茄子瓶装50ml琼脂培养基。灭菌后摆成斜面，凝固后的斜面至37℃下培养24h。确认无杂菌污染即可使用。

液体培养时，将液体培养基装入三角瓶中，使液层深度达45cm，于0.1MPa下湿热灭菌15min。按无菌操作接种。培养温度32℃。液体表面需7~10d，琼脂固体培养需6~7d。②

三级扩大培养可采用麸曲固体培养、液体表面培养或琼脂固体培养。

所用培养基如下：

a

麸曲培养基：

新鲜小麦麸皮1kg，加水1.1~1.3L。液体培养基与第二级扩大培养基所用液体培养基相同。

b琼脂固体培养基：

与斜面培养基相同。柠檬酸发酵是典型的好氧发酵，工业上好氧发酵基本上有三种，即表面发酵、固体发酵和液体深层发酵。前两者是利用气相中的氧，后者是利用溶解氧。这三种发酵方法都各有优缺点和经济可行性，工业上仍然在使用。3、

发酵生产

①

柠檬酸的液体深层发酵工艺

用液体深层发酵罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲，称为深层培养法。特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。①

柠檬酸的液体深层发酵工艺

（1）发酵温度黑曲霉发酵柠檬酸温度控制在28~30℃，柠檬酸产率最高，发酵速度较快，超过35℃时，虽然初期产酸较快，但最终的发酵产率降低15%以上。为了节约降温能耗，我国成功培育出高温发酵的产酸微生物，可以在37℃发酵。（2）pH在薯干粉发酵柠檬酸中，初始pH不加调节,约5.5。当接入菌种后，菌种生长繁殖，消耗氮源和铵离子，使培养基的PH下降，前期pH下降较快，活力强的菌种微生物培养12h后，ph可以降至2.5-3.0，24小时后可以降至2.2-2.3，这时会有少量的柠檬酸产生，但要到48小时后柠檬酸才大量产生，才使pH下降至2.0以下。①

柠檬酸的液体深层发酵工艺

（3）控制生物量正常的发酵液中生物量控制在12-20g/L，过多的生物量影响氧的溶解，增加发酵罐的搅拌，且消耗大量的葡萄糖，如果生物量的过度生长，柠檬酸的产率则迅速下降。（4）严防缺氧柠檬酸是耗氧发酵，对氧十分敏感，当发酵进入产酸期时只需要几分钟的缺氧时间，就会造成严重影响，甚至完全失败。对于突然停电等在所难免的事故，要采取紧急的补救措施，关闭进气阀，迅速启动备用电源，防止发酵罐料液倒流到空气过滤器中，用灭过菌的碳酸钙或石灰乳中和发酵液pH至2.5-3.5，然后恢复正常操作。①

柠檬酸的液体深层发酵工艺

（5）孢子接种数与菌球体的特征柠檬酸发酵液中的菌球体是有一个或数个孢子在生长过程物理作用形成的。菌球体的大小和数量关系到发酵的成败，一般来讲，菌球体越小、越多，产酸就越高，发酵周期也越短。菌球体的大小和数量与孢子接种量有关。②

表面发酵

采用表面发酵工艺具有一些优点：（1）设备简单，投资少，投产快；（2）操作技术简单，能耗低；（3）原料粗放，而且适于高浓度发酵，产酸浓度也较高；

但表面发酵存在的问题是设备占地面积大，劳动强度大，发酵时间长，菌体生长量多，而影响产率等。②

表面发酵

（1）一般发酵法根据菌种的产酸能力，液层一般在8~12cm，一次性发酵至结束。（2）置换法一次发酵结束，将酸液从菌膜下排走，然后在菌膜下通入无菌水，静止1小时，待菌膜中酸液渗入水中，排走洗水至贮酸桶，再通入置换液，液层视菌种生产能力而定，一般在6~8cm。②

表面发酵

（3）添加法有两种方法：一是分菌膜生长期和产酸期，生长期的液层3cm左右，待菌膜形成，放掉菌膜下的生长液，通入产酸培养基，液层在10~12cm，一直到发酵结束。另一种添加工艺是在液层为6~8cm的一段发酵基础上，待产酸进入高峰期通入3~4cm的产酸培养基，总液层达9~12cm，直至发酵结束。②

表面发酵

a一般发酵法具体操作：接种后，培养温度维持在35℃72h左右，这是黑曲霉的适宜生长温度，以促进孢子发芽及菌体发育。当温度逐渐下降时，必须通入约50℃的空气以维持35℃的培养温度。接种后20h左右可出现灰白色、很薄的菌膜，72h时菌膜已完全形成，菌膜相当厚且有皱褶。48h起由于菌体耗氧增加，可开动另一组风管向盘层之间通汽，进汽温度为40℃左右，进汽湿度为75%以上，以防培养液水分蒸发过快。接种后72h起进入产酸期，这时菌体代谢速率高，耗糖快，发酵液酸度急剧升高，并释放出大量热，此时应加强通风措施，严格将发酵温度控制在26~28℃，以利柠檬酸的形成。因此，一般在进入产酸期前8h左右需增大风量，且降低进汽温度在25℃以下，湿度仍在75%以上。160h以后发酵结束。

b

置换法置换法一般是采用糖浓度低而营养较丰富的培养液先培养菌盖，待菌盖形成之后再更换发酵培养基。可更换1次也可数次，发酵液用来提取柠檬酸。置换法的优点是节省了大量培菌时间，发酵速度快，而且原本不适宜长菌的原料都可用作发酵培养基。但为了保持菌盖的高活性，不能将发酵液残糖控制得很低，这样一来就造成替换出来的发酵液残糖量较高，给后道提取柠檬酸带来困难。分为浅盘发酵和厚层通风发酵，统称曲法发酵。固体发酵工艺具有的优点：（1）设备简单，投资少；（2）操作简单，能耗低，适应性强；（3）原料粗放，来源广泛，培养基简单；（4）发酵时间短缺点是设备占地面积大、劳动强度大，传质传热困难，产品回收率低，副产物多等。③

固体发酵

③

固体发酵

a

浅盘发酵浅盘固态发酵在发酵室内进行，发酵时也叫曲房，需要配置无菌空调设备，室内放置盘架，以8~10层为宜，架盘层垂直间距为15~20cm。浅盘发酵的容器可以采用发酵盘（曲盘、竹盘等）曲盘的厚度在6~8cm，材料可以是木质，铁质或不锈钢等，盘底最好是多孔篩板，以利于通气。③

固体发酵

a

浅盘发酵将曲置于曲室内培养，室温可按需要调节。在孢子发芽和菌丝生长期，由于产生的热量少，品温会逐渐下降，在入室后18h内，应维持品温在27~31℃。培养18~48h期间，由于发酵热的大量释放，品温上升很快，应采取措施，不得让品温超过43℃菌体活力下降，所以品温会下降，此时应维持在35℃左右，直至发酵结束。③

固体发酵

a

浅盘发酵为了克服上、下曲盘的温差，在发酵40h左右时应将曲盘上下对调。整个发酵期间不必翻曲。曲室相对湿度在85%~90%。发酵终点根据酸度来判定，从48h开始测量酸度，以后每隔12h测定1次，自72h以后则每隔4h测定1次，在酸度达到最高时即出料，否则时间延长，柠檬酸反而被菌体消化。③

固体发酵

a

浅盘发酵b

厚层通风发酵厚层发酵与空气的接触面小，所以需要在容器底部设置空气通道，以利于通氧，这种发酵设备又称发酵箱，这种发酵箱为厚层通风制曲箱，简称曲箱。大型的曲箱可以配置翻曲机，这样曲层可以加厚。b

厚层通风发酵机械通风固体曲发酵设备

1一输送带2一高位料斗3一送料小车4一曲料室5一进出料机6一料斗7一输送带8一鼓风机