中药复方制剂对大肠埃希菌多重耐药基因acra的影响

中药复方制剂对大肠埃希菌多重耐药基因acra的影响

中药复方制剂“连黄”由四种中药组成，具有良好的抗菌效果。经过大量实验，它对革兰氏阴性和阳性细菌（ektomykoli）、沙门氏菌（salmarkia）和金色球菌（stelbolococcusaureus）等阳性和阳性细菌产生了很好的抑制作用。本试验欲从分子生物学水平上初步探讨中药复方制剂“连黄”(粗提、精提)对大肠埃希菌耐药基因AcrA的影响,为中药新药的开发提供理论依据。1材料和方法1.1试验菌株、试剂和仪器试验菌种方面,敏感大肠埃希菌K88菌株由韩国国立兽医科学检疫院提供,耐药大肠埃希菌NUT菌株及多重耐药大肠埃希菌DL1菌株由延边大学农学院药理实验室提供。中药复方制剂“连黄”(粗提、精提)由延边大学农学院药理实验室提供。试验试剂方面,TaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000Marker购自宝生物工程(大连)有限公司;溶菌酶、蛋白酶K、DNA凝胶回收试剂盒购自北京基因组研究所。1.2方法1.2.1人才培养物的提取将5mL大肠埃希菌培养物培养18h,取3mL培养物,离心5min。具体提取方法按试剂盒提供的步骤进行。模板DNA含量的测定参照文献的方法进行。1.2.2tta-gacttagct以大肠杆菌基因组作为模板,设计一对上、下游引物,上游引物为:5′GACGA-CAAACAGGCCCAACA3′;下游引物为:5′TTAA-GACTTGGACTGTTCA3′。反应体系为50μL,灭菌双蒸水30μL,10×buffer5μL,5mmol·L-1dNTP4μL,10μmol·L-1引物各1μL,5UTagDNA聚合酶1μL,DNA模板8μL,PCR循环参数为94℃、30s,60℃、45s,72℃、60s,30个循环,最后一个循环72℃延伸至10min。1.2.3dna回收试剂盒回收取PCR产物50μL,1%琼脂糖凝胶电泳后,用鼎国公司的DNA回收试剂盒回收,方法参照说明书进行。将回收产物用ALF快速自动序列仪测序(上海生物技术工程服务有限公司完成),用Dnasis软件分析测序结果。1.2.4非均质试验1.2.5通过中药复方制剂的作用，pcr检测acra基因取耐药基因失活试验所得到的大肠埃希菌,重复前述的试验方法,检测经中药复方制剂亚抑菌浓度作用后的AcrA基因。2结果与分析2.1粗提“连黄”作用后模板dna含量中药作用前模板DNA含量的测定结果OD260/OD280=1.84;粗提“连黄”作用后模板DNA含量的测定结果OD260/OD280=1.84;精提“连黄”作用后模板DNA含量的测定结果OD260/OD280=1.85。2.2中药作用前后acra基因pcr扩增产物的电泳分析将经中药作用前后AcrA的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳30min,凝胶成像仪拍照,结果见图1。2.3基因段的序列分析2.3.1碱基序列的同源性分析结果表明测序结果与GeneBank中报道的登录号为ECU00734的AcrA基因序列进行对比分析,其同源性分析结果见图2。2.3.2氨基酸同源性分析的结果将测序结果与ECU00734的AcrA基因序列经DNASIA软件处理分析,得到氨基酸同源性分析,结果见图3。2.4中药复方制剂作用前后各菌株的acra检测结果将凝胶回收试剂盒所收集到的中药复方制剂作用前后的PCR回收产物送至上海生物技术工程服务有限公司测序。结果显示,目的片段长度为1005个核苷酸序列,其发生改变区域的碱基序列对比分析结果见图4。由图4可知,中药复方制剂作用前后各菌株的AcrA基因突变位点较集中,均分布在608~693碱基处。其中复方制剂作用后的DL1和NUT的突变碱基有6处不同。3中药复方制剂对阿斯塔纳的acra基因序列的影响本研究以具有较好抗菌作用的4种中草药为原料,分别用我国传统的水煎方法提取其主要成分,制成中药复方制剂“连黄”(粗提);用现代中药提取纯化技术对抗菌的主要成分进行精制,制成中药复方制剂“连黄”(精提),再用粗提和精提制剂分别作用已具有多重耐药基因的大肠埃希菌,然后采用PCR检测法,扩增出大肠埃希菌的耐药基因,并与未被中药作用的大肠埃希菌耐药基因序列进行对比分析。证明了精提制剂比粗提制剂对耐药基因的影响更大。本研究用中药复方制剂“连黄”作用多重耐药大肠埃希菌,应用PCR法扩增出的大肠埃希菌耐药基因AcrA与GeneBank中已报道的AcrA基因同源性均达99%以上,表明本实验室成功扩增出了大肠埃希菌耐药基因AcrA。但不同耐药菌株之间同源性存在差异,其中实验室诱导的DL1的AcrA基因序列与已报道的ECU00734的AcrA基因序列同源性达100%,其相应氨基酸同源性也达100%;而临床分离的耐药大肠埃希菌NUT与已报道的AcrA基因同源性达99%,有几个碱基发生突变,其相应氨基酸同源性也达98%。这种现象可能是由于耐药菌株来源不同而导致的。将两种中药复方制剂作用前后的AcrA基因序列进行对比,发现碱基突变位点较集中,且突变位点基本一致,在608~693处碱基改变较大,说明该区域可能为AcrA基因的突变区。其他区域个别碱基也有改变,其中中药复方制剂“连黄”(粗提)作用后的DL1菌株有5处突变,中药复方制剂“连黄”(精提)作用后的DL1菌株有8处突变,且有1处碱基产生缺失。说明经过现代的中药提取、分离纯化及精制技术制成的复方中药制剂的有效成分能更好地发挥药效功能,而临床分离的耐药大肠埃希菌NUT突变位点较少,仅为3处,此现象可能是由于临床耐药菌株具有较强地适应性、碱基发生改变较难所造成的。大肠埃希菌产生多重耐药性主要与AcrAB外排系统有关,AcrAB外排系统包括3个成分,分别是周质融合蛋白AcrA、外排转运子AcrB和多功能外膜蛋白TolC。3个成分协调配合,主动将菌体内的抗菌物质泵出细胞外,如果使该系统失活,则菌株即从多重耐药状态转变为敏感状态。因此抑制AcrAB外排系统的活性或降低其表达水平,均可使细菌对环境的适应能力及抗生素耐药水平下降,本试验已证