基于酶法体外转化的防风类成分升麻素的研究

基于酶法体外转化的防风类成分升麻素的研究

传统中医防风是伞状植物科的多年生针刺植物海防（turcz.）schichk干燥的根。其性温,味甘辛,归膀胱、肝、脾经,具有解表祛风、胜湿、止痉等功效。防风是我国重要的传统中药之一,始载于《神农本草经》,列为上品,已有几千年的药用历史。近年来国内外文献对防风的药理作用报道较多,防风提取物及某些成分具有解热、镇痛、镇静、抗炎、抗肿瘤、抗过敏、抗凝血等多种作用。研究表明色原酮类成分为其主要活性成分之一,且该类化合物中的升麻素苷在防风中含量较高,中国药典2010年版(一部)中,就以升麻素苷的含量作为评价防风质量的指标。但近来药理学研究发现:人肠内菌可将升麻素苷转化为升麻素(升麻素苷的苷元);升麻素为吸收良好的化合物,升麻素苷为吸收中等的化合物;升麻素才是防风的主要入血成分,而升麻素苷的入血量极微。上述多种药理学报道充分说明了升麻素才是防风在体内的主要代谢形式。因此,本文对酶法转化防风中含量较高的升麻素苷成升麻素的工艺进行了研究,酶解过程见图1,并通过HPLC探索最佳的酶解制备升麻素的条件,为应用复合酶制备生产升麻素提供依据。1药物、试剂和仪器防风(RadixSaposhnikoviae)购买于北京同仁堂药业有限公司,经吉林农业大学中药材学院郑毅男教授鉴定;植物精提复合酶SPE-007(夏盛实业集团有限公司);升麻素苷、升麻素(纯度>98.5%,批号111522、111710,中国食品药品检定研究院);甲醇(色谱纯,美国Tedia公司);甲醇、乙醇、冰醋酸等化学试剂(分析纯,北京化工厂);纯净水(娃哈哈集团有限公司)。岛津LC-2010高效液相色谱仪(日本岛津公司);JHBE-50S闪式提取器(河南金鼐科技有限公司);超声波清洗器KQ-250DB(昆山市超生仪器有限公司);SHA-CA水浴恒温振荡器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司);DK-98-1型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。2测试方法2.1植物精提复合酶活性的测定根据植物精提复合酶的生物学特性,进行预实验得出其反应最优pH为4.8。后精密量取pH为4.8的醋酸溶液10mL,置于40℃恒温水浴中预热后,加入定量的植物精提复合酶,40℃活化10min,再按所需比例加入定量的升麻素苷,最后在设定的温度下振荡一定时间。2.2乙醇溶液色谱称取药材防风1kg,加入9L50%的乙醇闪提,抽滤,重复3次,合并提取液,减压浓缩得浸膏137g。取浸膏50g,使用AB-8大孔吸附树脂色谱柱,分别用30%、50%、70%和90%的乙醇水溶液进行梯度洗脱,减压浓缩,得各梯度组分。取30%乙醇组分2g,使用ODS色谱柱进行柱色谱纯化,以30%甲醇洗脱,减压浓缩洗脱液,得升麻素苷粗品600mg。2.3单因素酶分解实验2.3.1酶解母液配制取pH为4.8的醋酸溶液7份各10mL,分别加入6、7、8、9、10、11、12mg的植物精提复合酶SPE-007,配制成浓度为0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2mg·mL-1的酶解母液,40℃活化10min。再称取7份上述分离到的升麻素苷各20mg,分别加入到活化后的母液中,在50℃水浴中振荡反应48h。反应结束后取出样品,对酶进行高温灭活,真空干燥,干粉用甲醇定容至100mL,0.45μm滤膜过滤后供HPLC分析。2.3.2酶解母液活化取6份pH为4.8的醋酸溶液各10mL,各加入等量的植物精提复合酶SPE-007,配制成最佳酶浓度(由上述酶浓度单因素实验证明得到)的酶解母液6份,40℃活化10min。再称取6份各20mg的升麻素苷分别加入到活化后的母液中,在温度分别为35、40、45、50、55、60℃的水浴中振荡反应48h。反应结束后取出样品,对酶进行高温灭活,真空干燥,干粉用甲醇定容至100mL,0.45μm滤膜过滤后供HPLC分析。2.3.3酶解母液的活化取6份pH为4.8的醋酸溶液各10mL,各加入等量的植物精提复合酶配制成最佳酶浓度(由酶浓度单因素实验证明得到)的酶解母液6份,40℃活化10min。再称取6份各20mg的升麻素苷分别加入到活化后的母液中,在最佳温度(由上述酶解温度的单因素实验证明得到)的水浴中振荡反应,时间分别为8、16、24、32、40、48h。反应结束后取出样品,对酶进行高温灭活,真空干燥,干粉用甲醇定容至100mL,0.45μm滤膜过滤后供HPLC分析。2.4采用高效液相色谱法测定了升麻素核苷酸和升麻素的含量2.4.1对照品溶液的制备精密称定升麻素苷5mg和升麻素4mg,分别用甲醇定容于10mL量瓶和25mL量瓶中,制成0.5mg·mL-1升麻素苷对照品溶液和0.16mg·mL-1升麻素对照品溶液,再吸取升麻素苷对照品溶液100μL和升麻素对照品溶液200μL,两者混匀即得。2.4.2供试品溶液配制精密称定分离得到的升麻素苷粗品20mg,加甲醇定溶于100mL量瓶中作为空白供试品溶液,样品供试品溶液的配制参照上述酶解方法中各单因素试验。2.4.3色谱条件检测色谱柱:HypersilODS柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:甲醇(A)-水(B),梯度洗脱(0～20min,20%→45%A;20～40min,45%→70%A);检测波长:254nm;流速:1.0mL·min-1。在上述色谱条件下色谱图见图2。结果表明,升麻素苷和升麻素峰分离效果较好,且各成分理论塔板数不低于3000。2.4.4升麻素苷、升麻素的线性回归分析精密吸取混合对照品溶液5、10、15、20、25、30μL,进样测定,以进样量为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归,得升麻素苷、升麻素的回归方程分别为:Y=13.387X-14.658r=0.9992Y=4.596X-6.549r=0.9991表明升麻素苷在0.834～5.001μg、升麻素在0.534～3.201μg线性关系良好。2.4.5进样稳定性试验精密吸取混合对照品溶液20μL,在上述色谱条件下进样,连续重复6次,记录峰面积,计算得升麻素苷和升麻素峰面积的RSD分别为0.76%和0.93%。结果表明此方法精密度良好。2.4.6进样测定的结果按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液,分别在0、3、6、9、12、15、18、21、24h后在上述色谱条件下进样测定,结果升麻素苷和升麻素峰面积的RSD分别为0.98%和1.0%。表明供试品溶液中的升麻素苷和升麻素在室温条件下24h内稳定。2.4.7进样稳定性试验按“2.4.2”项下方法分别制备6份供试品溶液,在上述色谱条件下各进样20μL,记录峰面积,结果供试品中升麻素苷和升麻素峰面积的RSD分别为1.1%和1.5%。重复性较好。2.4.8加样回收率试验各取升麻素苷粗品(测定含量为30%)和酶解后30%的升麻素6份,精密称定,每份2mg,分别加入一定量的升麻素苷和升麻素混合对照品溶液,按“2.4.2”项下方法制备成供试溶液,依照“2.4.3”项下色谱条件进样20μL,测定回收率。结果升麻素苷平均回收率为102.7%,RSD为1.4%;升麻素的平均回收率为102.3%,RSD为1.5%。3结果与分析3.1酶浓度对升麻素苷转化率的影响本研究以升麻素苷的转化率为评价指标[计算方法:(酶解前升麻素苷含量-酶解后升麻素苷含量)/酶解前升麻素苷含量],对不同酶浓度条件下的升麻素苷转化率进行测定,结果见图3。如图所示,当酶浓度在0.6～1.1mg·mL-1时,升麻素苷的转化率与酶浓度呈正相关;当酶浓度为1.1mg·mL-1以上时,升麻素苷转化率不再随酶浓度的增加而增大。这是因为当酶浓度低于1.1mg·mL-1时,随着酶量的增加,越来越多的升麻素苷与酶结合反应,因此转化率升高;而当酶浓度达到1.1mg·mL-1时,该酶达到饱和浓度,升麻素苷基本全部被酶解,因此转化率最高,不再随酶浓度的增加而增大。本研究同时对酶浓度为1.1mg·mL-1时酶解后反应液中升麻素的含量进行测定,结果显示其与酶解前升麻素苷的含量基本相同,进一步说明在植物精提复合酶SPE-007浓度为1.1mg·mL-1时升麻素苷转化相对完全,升麻素得率最大。3.2酶解温度对升麻素苷转化率的影响不同酶解温度下升麻素苷的转化率见图4。如图所示,当酶解温度在40～50℃时,升麻素苷的转化率随温度的增加而增大;50℃时达较大值,为95.12%;50℃以上时,转化率随温度的增加反而降低。因为当温度在50℃以下时,酶活性随温度增加而增强,且有利于提高酶解速率;当温度达50℃以上时,部分酶蛋白发生变性,升麻素苷的转化率因受之影响而降低。在本研究中为进一步提高升麻素苷的转化率,又对酶解温度分别为45、46、47、48、49、50℃时的升麻素苷转化率按照“2.3.2”项下方法进行测定,结果显示当酶解温度为48℃时,升麻素苷的转化率最大,为99.82%。同时对酶解温度为48℃时,酶解后反应液中升麻素的含量与酶解前升麻素苷的含量进行比较,结果表明两者含量基本相同,进一步说明在酶解温度为48℃时,升麻素苷较完全地转化为升麻素。3.3间的延长变化酶解时间对升麻素苷转化率的影响如图5所示:升麻素苷的转化率在酶解时间为40h之前随时间的延长明显增大,而在40h以后随时间的延长变化较小。这是由于酶解时间的延长,酶活力得到充分利用,酶解进行越完全,升麻素苷的转化率就越大。本研究为保证升麻素苷的酶解反应进行相对完全,将酶解时间选为48h,此时升麻素苷的转化率为99.80%。此外,本研究对当酶解温度为48℃时,酶解后反应液中升麻素的含量与酶解前升麻素苷的含量进行比较,结果显示两者含量基本相同,说明此时升麻素苷经酶解反应,基本全部转化成升麻素。4酶法分离升麻素苷,特点稳定性强本文通过先前实验分离制备出了纯度为30%的升麻素苷,并在梯度洗脱的色谱条件下进行检测,旨在说明所进行的酶解反应底物仅包含升麻素苷一种主要色原酮类成分,进而对杂质性成分进行分析,可以确定底物中不含可干扰结果的糖苷类物质,即不影响对升麻素苷转化率的计算。从前期获得升麻素苷来看,推测杂质为色素等脂溶性成分,该类成分不干扰酶转化的过程。本文首次报道了通过酶法转化升麻素苷来制备升麻素的方法,此法简单高效,结果稳定可靠,为工业化生产制备升麻素提供了一种可行、有效的方法。由于在防风中升麻素主要以糖苷(即升麻素苷)的形式存在,升麻素苷的含量远远大于升麻素,在防风中含量很高,故本试验以药材防风为升麻素苷的来源,经简单的提取分离即得到了大量较高纯度的升麻素苷成分。同时,酶转化方法具有反应条件温和、效率高、易于控制、操