夹竹桃叶乙醇粗提物的提取及毒性研究

夹竹桃叶乙醇粗提物的提取及毒性研究

竹桃是竹桃科的一种多年生垂直灌木。在我国长江以南各地广泛种植,多栽培在路旁、庭院、公园、河堤、湖畔等地。夹竹桃对多种害虫具有胃毒、触杀、拒食、抑制生长发育等作用,能吸收空气中有害气体以净化环境,并具有重要的药用价值。研究表明,夹竹桃全株或其根、茎、叶、花提取物对棉花害虫(棉铃虫)、水稻害虫(二化螟、稻飞虱)、蔬菜害虫(菜青虫、蚜虫)以及储粮害虫(米象、绿豆象、四纹豆象)等多种害虫具有胃毒、触杀、拒食、抑制生长发育作用。夹竹桃提取液还有抑菌、杀线虫和杀钉螺作用。我们的研究表明,夹竹桃叶乙醇提取物对福寿螺也有显著的毒杀作用。虽有夹竹桃提取物对鱼的毒性试验,但对实验动物鼠、兔等的毒性如何未曾评价。为了从夹竹桃植物中开发植物源杀螺剂,非常有必要评价其毒理学。有关农药对鱼类的安全性,国际上常用试验鱼种有斑马鱼、鲤鱼、夏裨鱼、黑头软口鲦、翻车鱼等。目前夹竹桃提取物对鱼类的安全性评价仅见何亮华等的报道。本文在夹竹桃叶乙醇粗提物和精提物提取分离的基础上,进一步评价乙醇粗提物对实验动物的安全性,测定其对水生生物(斑马鱼)的急性和慢性毒性,为准确评价夹竹桃植物对水生生物的安全性及合理开发夹竹桃植物提供科学依据。1材料和方法1.1绿桃叶原粉的制备夹竹桃叶原粉:夹竹桃叶采自浙江省农业科学院院外路旁,用清水洗净后置烘箱中60℃烘干72h,电动粉粹机粉碎至40—60目,得夹竹桃叶原粉,待用。斑马鱼(Brachydaniorerio),购于杭州花鸟市场,试验鱼平均体长为23.3mm,体宽为4.6mm。1.2急性毒性试验乙醇粗提物的制备采用索氏提取法,参考董道青等的提取方法。称取夹竹桃叶原粉50g,加入质量分数为70%的乙醇250mL,在室温(25℃)下提取8h,得乙醇提取液。多次重复该过程,可获得大量的乙醇提取液,减压浓缩后得乙醇粗提物用于试验。乙醇精提物的制备参考董道青等的提取方法。夹竹桃叶原粉,通过70%乙醇浸泡、过滤、活性炭回流脱、减压浓缩、萃取、再减压浓缩、柱层析等步骤,得到乙醇精提物,经鉴定为强心甙组分。乙醇粗提物对斑马鱼的急性和慢性毒性试验急性毒性试验:试验在水盆中进行。设4个浓度(8、16、24、32mg/L),一个清水空白对照。重复3次。每个水盆加3L水,将上述配好的乙醇粗提物倒入相应的盆中,用玻璃棒充分搅拌,使药物分布均匀,然后在每个盆中分别放入15条鱼。在药后12、24、48、72、96h时检查记录鱼的死亡情况,并捞出死鱼,计算死亡率。试验过程中用增氧机增氧。慢性毒性试验:试验也在水盆中进行。设4个浓度(1.67、3.33、6.67、10.00mg/L)处理,一个清水空白对照。其他过程同急性试验。每4天换一次新鲜药液,直至试验结束。在药后6h、12h、24h、48h、…、28d检查记录鱼的死亡情况,并捞出死鱼,计算死亡率。乙醇精提物对斑马鱼的急性毒性试验试验在水盆中进行,设4个浓度(0.125、0.25、0.5、1mg/L),一个清水空白对照。重复3次。其他试验过程同粗提物的急性毒性试验。在药后6、12、24、48、72、96h检查记录鱼的死亡情况,并捞出死鱼,计算死亡率。鱼中毒死亡的判断标准:以鳃盖是否停止活动和对轻微刺激有无反应作为判断依据。试验鱼中毒后俯卧或侧卧于盆底鳃盖停止活动,用玻璃棒或小镊子轻轻刺激尾部,5min内无反应即可以确定为个体死亡。1.3数据分析的方法试验数据用Excel、DPS3.01数据处理软件进行统计分析。2结果2.1乙醇的提取率图1是通过上述一系列方法得到的乙醇粗提物和精提物。结果表明,40g夹竹桃干粉中得到18g乙醇粗提物(浓缩后精膏的重量),即提取率为45%;进一步提取分离得到100mg乙醇精提物(其主要成分为强心甙组分),即提取率约为0.25%。2.2粗提物的安全性图2显示,用不同浓度的乙醇粗提物(8、16、24、32mg/L)处理斑马鱼,发现斑马鱼的死亡率与药剂剂量和处理时间均呈明显的正相关。粗提物浓度越大,斑马鱼的死亡率越高。8mg/L处理后,斑马鱼的校正死亡率均在22.22%以下;16mg/L处理后,随处理时间延长,死亡率明显增加,24h的校正死亡率为34.21%,48h为51.35%,96h为61.11%。24mg/L处理后,24h死亡率达90%左右,48h达95%,96h全部死亡。32mg/L处理24h,其死亡率即达97%以上,48h全部死亡。2.3乙醇粗提物对斑马鱼的毒杀活性图3显示,用不同浓度的乙醇粗提物(1.67、3.33、6.67、10.00mg/L)处理斑马鱼,斑马鱼的死亡率与药剂剂量和处理时间之间的相关性不明显。用10mg/L的乙醇粗提物处理28d,其死亡率为20%左右;用3.33mg/L的乙醇粗提物处理,28d后鱼的死亡率最高也不超过12%。表1显示乙醇粗提物对斑马鱼的毒杀活性随处理时间的延长而提高。处理斑马鱼96h后,LC50=12.52>10mg/L,根据《化学农药环境安全评价试验准则》中农药对鱼类的毒性一般按LC50的大小划分为三个等级:>10mg/L为低毒农药,1.0—10mg/L为中毒农药,<1.0mg/L为高毒农药,说明夹竹桃叶乙醇粗提物对斑马鱼的毒性为低毒,较安全。2.4斑马鱼的死亡率图4显示,斑马鱼的死亡率与夹竹桃叶精提物(强心甙组分)剂量和处理时间均呈明显正相关。精提物浓度越大,斑马鱼的死亡率越高。0.25mg/L及以下浓度处理后,斑马鱼的死亡率在10%以下;0.5mg/L处理12h,其死亡率在10%以下,处理24h死亡率为35%左右,48h后死亡率在50%以上,到96h死亡率接近60%。1mg/L处理12h,斑马鱼的死亡率为70%左右;24h后斑马鱼全部死亡。表2显示乙醇精提物处理斑马鱼96h后,LC50=0.46,<1mg/L,根据《化学农药环境安全评价试验准则》中农药对鱼类的毒性分级标准,说明精提物毒性为高毒,非常不安全。3夹竹桃叶的急性毒性效应本文中的夹竹桃叶乙醇粗提取物和精提物经试验,对福寿螺具有显著的毒杀作用。夹竹桃叶乙醇粗提物中的主要成分有强心甙、萜类、甾类等混合物质,含量约占10%以下;乙醇精提物的提取是参考陈业高的方法从夹竹桃中分离出来的,文献记载按此方法提取的物质经鉴定为强心甙。强心甙是一类对心肌有兴奋作用的甾体化合物,多为无色结晶或无定形粉末,对黏膜有刺激性,其基本结构是由甾醇母核和连载C17位上的不饱和共轭内酯环构成甙元部分,然后通过甾醇母核C3位上的羟基和糖缩合而成。经浙江省医学科学院对夹竹桃叶乙醇粗提物毒理学的评价结果(根据GB15670-1995《农药登记毒理学试验方法》的各种指标的分级标准)表明,夹竹桃叶乙醇粗提物对大鼠急性经口和急性经皮为低毒、对家兔皮肤和眼无刺激、对豚鼠表现弱致敏性。这说明夹竹桃叶乙醇粗提物属低毒,对哺乳动物十分安全。斑马鱼是国际标准化组织推荐使用的鱼类毒性试验动物。许多学者利用斑马鱼作为模式生物,研究了农药(杀虫剂、杀菌剂和除草剂)、农药助剂、中药成分等对斑马鱼的急性毒性[12—22]。但有关夹竹桃提取物对鱼类的毒性评价仅见一篇,何亮华等采用静水式法研究了夹竹桃枝条、叶提取物对鲤科鱼类(鲤鱼Cyprinuscarpio、鳊鱼Parabramispekinensis、白鲢Hypohythamicthysmolitris)的毒性试验,发现对这三种鱼的LC50分别为66.09、40.63和48.71mg/L(药后96h),安全浓度为6.61、4.06和4.87mg/L。但至今仍未见夹竹桃叶提取物对斑马鱼的安全性评价的报道。本实验结果证实,夹竹桃叶乙醇粗提物和乙醇精提物(强心甙组分)对斑马鱼的急性毒性LC50分别为12.52和0.46mg/L(药后96h),分别属于低毒比较安全和高毒不安全。这说明本文提取的对福寿螺有显著毒杀作用的夹竹桃叶乙醇粗提物和精提物(强心甙成分)对斑马鱼的毒性明显高于何亮华等的夹竹桃提取物对鲤科的毒性,可能由于二者提取物的活性成分不同所致。在试验中观察到夹竹桃叶处理后斑马鱼表现出的中毒过程:先被麻痹,发生游动缓慢,反映迟钝,进而发生侧翻,最后死亡。夹竹桃叶粗提物对斑马鱼的毒性低且原材料简便易得,精提物的毒性强,但可以在农药的加工过程中减少原药的含量,多增加些其他成分,以减少对鱼类的毒性。所以在实际应用中,尤其在养鱼的农田中使用夹竹桃叶乙醇精提物防治福寿螺等有害生物时应注意对水生生物鱼类的安全性,避免鱼的伤亡。4乙醇精提物强心充物对斑马鱼的