黄芩制剂抗病毒和保护细胞作用机制研究

黄芩制剂抗病毒和保护细胞作用机制研究

黄鼠狼是一种常见的清热解毒药物。它具有净化火焰、消除湿热、止血、安胎的作用。其主要成分是黄酮类化合物。现代药理研究表明,黄芩中黄芩苷、黄芩苷元等有效成分具有抗微生物、抗炎抗变态反应、解热等作用。研究发现,黄芩煎剂体外对流感病毒PR8株有抑制作用,小鼠感染病毒后,能减轻肺部损伤和延长存活时间。临床上应用以黄芩为臣药的复方中药制剂治疗柯萨奇病毒B3m所致的病毒性心肌炎,无论在临床症状、体征恢复上,还是在心电图的改善上均有明显疗效。在本次研究中采用了两种不同的提取方法:一种是保留尽可能多的黄芩苷为主的精提法,一种是尽可能多的保存黄酮类化合物成分的粗提法。对两种黄芩制剂进行比较,以抑制病毒指数为指标检测两者灭活病毒能力,应用细胞病变效应(CPE)和四甲基偶氮唑蓝(MTT)两种检测方法比较其保护细胞的不同效果,从而探讨黄芩提取物抗病毒和保护细胞作用的机制,为中药有效成分作用机制研究提供依据。目前认为病毒的直接作用及其引发的心肌组织的自身免疫损伤是病毒性心肌炎(VMC)的主要病理机制。流行病学研究表明,柯萨奇B组病毒是人类病毒性心肌炎(VMC)的主要病原。迄今为止,国内外现代医学界仍然以营养心肌等支持疗法作为VMC的主要治疗方法,因而探讨有效的抗病毒及保护心肌细胞的药物势在必行,这也是中医药领域对VMC防治研究的一大热点。1材料和试剂1.1中毒的场所CVB3m(Nancy株,上海中山医院病毒性心肌炎重点实验室杨英珍教授惠赠)。测TCID50为3.65×10-4。1.2ps和mem黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所);DMEM(美国Gibco公司);青霉素、链霉素(PS)(沈阳第六制药厂);MTT(华美试剂公司,用培养液配制成5g·L-1的溶液)。1.3培养箱和显微镜LC-6A高效液相色谱仪(日本岛津公司),紫外检测器,大连中北色谱工作站。4950ECO2培养箱(Nuaire公司);Benchmark酶标仪(Bio-RAD公司);倒置显微镜(LECIA公司);CMIAS医学图像分析管理系统(北京中山公司);超低温冰箱MDF382E(SONY公司);生物安全柜(Nuaire公司);微量细胞培养板(COSTAR公司)。1.4色谱柱及流动相Shim-packCLC-ODS(4.6mm×200mm,5μm)色谱柱;检测波长:278nm;流动相:甲醇-0.025mol·L-1(45∶55);流速1.0mL·min-1。2方法2.1中药风味处理2.1.1含生药的制备由辽宁中医学院临床药理基地实验室制备,具体流程:黄芩饮片5kg加入8倍体积的70%乙醇(体积分数)中,置高能提取罐内回流提取2次,每次1.5h,滤过,合并滤液。取剩余药物残渣,加入8倍量水常压提取2次,每次1h,滤过,合并滤液。将每组药物的醇提取液和水提取液分别置单放浓缩缸内减压浓缩,然后分别将醇提和水提的浓缩液混匀,置高速离心喷雾干燥机中进行喷雾干燥,收集干燥粉,保存备用。将粗提物分别用蒸馏水配制成体外实验用溶液,均为含生药100g·L-1。将溶液离心取上清液,滤膜过滤,高压灭菌备用。2.1.2ph值的提取黄芩粗粉加8倍沸水中每次煮1h,煮3次,滤过,合并滤液;将药液加入浓盐酸中调pH值为2,酸液加热80℃,保温静置30min。将沉淀用热水洗2~3次,抽干;沉淀中加10倍水,混匀,用质量分数40%氢氧化钠调pH值为6~7,加入样品量质量分数3%的活性碳,50℃保温30min,滤过;将滤液加等体积体积分数95%乙醇,用浓盐酸调pH值为2,滤过;将沉淀用体积分数50%乙醇4倍洗,体积分数95%乙醇4倍洗,烘干,得到黄芩精提物。精密称取黄芩精提物500mg,放入量瓶中,加蒸馏水至100mL,水浴超声30min,高温灭菌,调pH值为7.2,离心取上清备用。其质量浓度为10g·L-1。2.2对照溶液的制备精密称取干燥恒重的黄芩苷对照品适量,配成1mL含0.1586mg的对照品溶液。2.3测量法精密吸取对照品溶液10μL,供试品溶液5μL,注入高效液相色谱仪,测定峰面积,计算含量。2.4细胞生长观察用培养液将两组药物分别按1∶2倍比稀释,加入已制备好的单层Hela细胞上,每孔200μL,每一稀释度设4个复孔。正常细胞组以培养液代替药液,培养3d,逐日观察细胞生长情况。计算药物最大无毒浓度(TD0)。2.5病毒滴度法和抑制病毒指数测定将各组药液分别与200TCID50的CVB3m病毒液等量混合,最终浓度分别为TD0,1/2TD0和1/4TD0,然后置37℃作用2h;同时病毒对照组以培养液代替药液与200TCID50的病毒等量混合后置37℃作用2h,而后用微量细胞板分别测定药物组和病毒组的病毒滴度,以最后1dCPE达“++”(50%细胞出现病变)以上病变为阳性孔,无病变或病变在50%或以下作为阴性孔,按Reed-Muench法测定病毒的TCID50。然后计算各组药物的抑制病毒指数。抑制病毒指数=︱病毒对照组logTCID50-药物组logTCID50︱。2.6细胞活性检测药物分组:两种药物分3个浓度TD0,1/2TD0,1/4TD0,每种浓度分①预防性保护组:每孔以含药物维持液于感染前培养24h,24h后吸出药液,用Hank’s液洗3次,每孔加入100TCID50CVB3m100μL吸附1h后,加维持液培养。②感染后保护组:在单层细胞培养板中加入100TCID50CVB3m100μL吸附1h,用Hank’s液洗去病毒,加含药维持液培养。同时设正常细胞对照组、病毒对照组。检测指标:观察CPE和MTT法检测细胞活性。①观察CPE:每组自接种病毒24h后,逐日在倒置显微镜下观察CPE。25%CPE为“+”;50%CPE为“++”;75%CPE为“+++”;100%CPE为“++++”。②MTT法检测细胞活性:接种病毒72h后,吸弃培养上清液,用37℃pH7.6的PBS洗涤1次,每孔加180μL培养液,再加入20μLMTT溶液,37℃孵育4h。小心吸弃孔内培养上清液100μL,加入等量含0.04mmol·L-1盐酸异丙醇溶液,振荡5min,使结晶物充分溶解,选择490nm波长酶标检测仪测定各孔吸光度值(A),记录结果。计算药物保护率=(感染给药组A-病毒对照组A)/(正常细胞对照组A-病毒对照组A)×100%。2.7统计学分析采用SPSS11.5医学统计软件进行分析,计量资料以均数±标准差表示,3组的计量资料分析采用单因素的方差分析,两两比较采用LSD分析方法。3结果3.1药物组对小鼠cpe情况的影响加入药物72h后观察结果:黄芩粗提物浓度≥3.125g·L-1时,细胞有不同程度的胀大,变圆,细胞内有粗大颗粒,部分细胞脱落;黄芩精提物浓度≥2.50g·L-1时,细胞开始出现病变;正常对照组细胞生长良好。各药物组CPE情况采用倒置显微镜观察,见表1。黄芩粗提物对Hela细胞的TD0为1.563g·L-1,黄芩精提物的TD0为1.25g·L-1。3.2对体外直接灭活病毒作用的抑病毒指数检测两组药物作用后病毒滴度均有所下降,从抑制指数来分析,黄芩粗提物组在TD0浓度时,抑制病毒指数大于2,表现出明显的直接灭活病毒作用;而黄芩精提物组在TD0,1/2TD0,1/4TD0浓度的抑病毒指数均小于2。提示在体外直接灭活病毒作用方面,黄芩精提物作用不明显。结果见表2。3.3两组的预防保护率结果见表3,4和图1,2。根据CPE法和MTT法两种检测方法,两组药物的预防保护率无显著性差异(P>0.05);两组药物均有明显的保护病毒感染细胞的作用,而黄芩粗提物组在1/2TD0浓度时治疗保护率明显高于黄芩精提物组,具有显著性差异(P<0.05)。3.4复配中黄芪苷质量分数的检测黄芩粗提物组具有色谱峰数量多,而黄芩精提物组的色谱峰明显少于黄芩粗提物组,黄芩粗提物的黄芩苷质量分数为2.691%;而黄芩精提物中黄芩苷质量分数为3.826%。药物浓度在TD0时,黄芩粗提物中黄芩苷为0.042g·L-1;而黄芩精提物中黄芩苷为0.048g·L-1。两组药物中TD0时黄芩苷含量相似。4合成cem-hiv在细胞毒性作用黄芩作为传统中药,其生物活性是多方面的。国内在细胞水平对黄芩活性部分的生物活性及作用机制的研究很少。黄芩有效成分在药理上已经证实的作用有:黄芩苷有抑菌、清热、降压、镇静、利尿、利胆、抗炎、抗变态反应等活性;黄芩素有抑菌、利尿、抗炎、抗变态反应、利胆等活性;汉黄芩素具有抑菌、利尿、解痉等作用。黄芩的抗病毒作用早已被人们发现,从黄芩中提取的异黄芩素-8-甲醚能显著抑制流感病毒;黄芩苷对人T细胞白血病病毒Ⅰ型(HTLV-Ⅰ)的抑制呈剂量-效应关系,其作用机制是抑制HTLV-Ⅰ的反转录酶;黄芩素是一种强的鼠白血病病毒(MLV)和人免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶活性的抑制剂,2mg·L-1的黄芩素对MLV和HIV的逆转录酶活性抑制率在90%以上;另外的研究发现,黄芩苷在一定浓度下对体外培养的T细胞株CEM无细胞毒性,而对感染HIV病毒的CEM细胞则发生明显的细胞毒性,引起细胞DNA发生断裂,对高容量释放HIV病毒CEM-HIV细胞效应尤为明显,推测黄芩苷的抗HIV作用可能与选择性地诱导高病毒释放的细胞导致CEM-HIV细胞的凋亡有关。笔者采用两种不同的提取方法,一种以保留尽可能多的黄芩苷为主的精提法,另一种则尽可能多的保存黄酮类化合物成分的粗提法。对两种不同提取方法制备的黄芩制剂进行指纹图谱分析,结果表明,黄芩粗提物可标出11个指纹峰,以黄芩苷为参比,色谱峰的相对面积计算可知,黄芩粗提物的相对峰面积均大于黄芩精提物的相对峰面积,黄芩粗提物的色谱峰较精提物色谱峰多,成分较黄芩精提物复杂,两组药物浓度TD0中所含黄芩苷浓度相似。黄芩粗提物组在TD0浓度时,抑制病毒指数大于2,表现出明显的直接灭活病毒作用,而黄芩精提物的抑制病毒指数均小于2,提示黄芩精提物直接灭活病毒作用不明显。根据两种药物成分分析可推测,黄芩粗提物制剂中除黄芩精提物主要成分外的其他黄酮类成分在直接灭活病毒方面可能发挥了重要作用。两组制剂均有明显的保护病毒感染后细胞作用,说明在治疗保护方面,黄芩精提物中主要成分起到了重要作用。黄芩粗提物在1/2TD0时治疗保护作用优于黄芩精提物组,可推测黄芩粗提物中其他成分也可能发挥了作用。两组制剂均有明显的保护病毒感染后细胞作用,虽然黄芩粗提物在1/2TD0时治疗保护作用优于黄芩精提物组,但在TD0和1/4TD0浓度时二者作用无显著差异,无明显量效关系,因此两种制剂在保护病毒感染后细胞作