中药与方剂的血清药物化学及代谢组学研究思路

中药与方剂的血清药物化学及代谢组学研究思路

中医学是在传统中医的指导下应用的天然药物。这是中医临床治疗的起始材料。而方剂是中医临床用药的主要应用形式,是中医临床治疗经验的精髓,它是在中医“理法方药”理论指导下,由多味中药按君、臣、佐、使的分工合作原则配伍成的“有制之师”,在七情合和的相互关系中发挥临床治疗效应。中药的多成分组成特点,决定了多味药组成方剂的药味和成分间关系的高度复杂性,致使方剂配伍规律揭示滞后且滞留在饮片层面的利用传统理论诠释用药经验的水平。这种格局,限制了中医临床经验的有效继承,使基于中医临床的创新药物研究举步维艰。为此,必须通过阐明中药与方剂体内的化学生物标记物及活性生物标记物的动态规律,从体内直接作用物质及其与病证生物标记物的代谢轨迹变化水平,深层次挖掘中药与方剂中组分间的关系,为临床疗效的提高(科学使用)及创新药物(先导化合物的发现)提供有效的依据。近年来,伴随中药血清药物化学的发展和后基因时代的代谢组学出现,使认识中药与方剂的体内直接作用物质及其与病证生物标记物成为可能,为阐述中药与方剂中组分间协同增效作用(synergeticeffect)提供了方法学基础。本文将结合近期对刺五加、六味地黄丸及茵陈蒿汤等中药与方剂的血清药物化学及代谢组学研究结果,提出立足于药物与人体间相互作用、药物与药物间相互作用的中药与方剂中组分间关系的研究思路。1药物代谢产物中药多数来源于植物,在古代被称为本草,其成分复杂,在体内的直接作用物质并不是植物自身次生代谢产物的简单吸收,而是成分相互间协调的合作,对体内直接作用物质的形成及其时-量-效关系的协调产生积极的影响。刺五加为Acanthopanaxsenticosus(Rupr.etMaxim.)Harms的根及根茎、茎枝。刺五加提取物(标准化)口服给药后,在血清中分析检测了19个成分,其中8个为代谢产物,其余为生药中的原型成分。峰5,10,11,13,16和17被分别鉴定为原儿茶酸、刺五加苷B、绿原酸、咖啡酸、刺五加苷D及异秦皮啶,峰1,2,3,7,12,14,18和19为代谢产物(图1)。在原型成分中原儿茶酸、刺五加苷B、绿原酸、咖啡酸、刺五加苷E和异秦皮啶是主要成分。而且另有3个代谢物为刺五加苷B的代谢产物,如果余下的代谢产物衍生于上述6种原型化合物之一,那么6个成分应该是血中成分的主体,是刺五加主要的体内直接作用物质(药效物质基础)。在6个原型成分中,异秦皮啶在体外含量较小,但在体内含量却相对较高,增加明显。为此,对其进行经时动态研究,发现口服刺五加提取物后的异嗪皮啶的药-时曲线表现出双吸收峰行为(图2)。将所得数据以给药后4h为分界点进行分段(0-4h和4-24h),房室拟和和参数计算参数分析,结果表明第一段是给药后0-4h,其吸收行为与口服异秦皮啶单体化合物所表现的行为相似,疑为游离的异秦皮啶行为;而从4-24h吸收过程可以观察到AUC显著加大,其相对值是0-4h段的3倍以上,且吸收和消除显著减慢。对4-24h所致二次吸收进行分析,发现异秦皮啶处于极性谱的偏脂溶性区域,有发生肝肠循环的可能性,但同时观察其单体给药仅出现单峰行为,可排除由于肝肠循环引起的可能性。经LC-MS-MS分析,刺五加中含有多种与异秦皮啶化学结构相似的化合物,如刺五加苷B1(eleutherosideB1),它是异秦皮啶7-葡萄糖苷,在酶、酸性及加热条件下易水解,生成异秦皮啶,此过程体外实验已经证实。由于刺五加苷B1在刺五加中的天然含量是异秦皮啶的3-5倍,这在物质绝对量层面恰好验证了第二吸收过程AUC是第一吸收过程3倍以上的实验结果。刺五加提取物给药后异秦皮啶药代动力学行为有别于异嗪皮啶单体化合物出现双吸收峰现象,是刺五加中游离型异嗪皮啶和前体化合物生物转化共同作用的结果,刺五加提取物相当于异嗪皮啶的缓释系统,而表现出更高的生物利用度和更加持久的药效,这既是刺五加提取物较异嗪皮啶给药的优势,又是中药成分间代谢相互关系的体现。2基于中医临床经验的创新药物研究方剂(复方)是中医临床治疗经验的具体体现,是中药创新药物的源泉,充分认识方剂中药物之间的关系,有助于基于中医临床经验的创新药物研究工作。然而,方剂是由多个中药按君、臣、佐、使的分工合作原则配伍,在人体与药物、药物与药物相互作用的协调中发挥临床治疗效应。方剂体内的直接作用物质不是单味药体内吸收成分的简单加和,而是由于配伍的原因,有选择地定向吸收对治疗有用成分,从分体现了“有制之师”的配伍意义。2.1不同药物的配伍对药代动力学行为的影响茵陈蒿汤始载汉代张仲景的《伤寒论》,主治湿热黄疸。利用UPLC/MS技术分析表征了口服茵陈蒿汤后21个血中移行成分。通过与单味药、组方药物组合配伍样品的体内成分轮廓比较,发现吸收入血的21个化合物中,有8个化合物只有在茵陈蒿汤全方口服给药后才能专属性地吸收入血,而在单味药或任意组合药对中均未吸收,经追踪8个化合物的相关联的生物效应,表明此8个成分均具有显著的保肝利胆活性,可见从药物代谢组学层面阐明方剂体内直接作用物质随配伍变化的规律来诠释方剂药物间的相互作用是有效的途径。研究来源于君药茵陈蒿的体内成分6,7-二甲氧基香豆素在配伍条件下的药代动力学行为,结果显示,随着方剂组成的改变,6,7-二甲氧基香豆素的药代动力学行为向有利于疗效发挥方面转化,而且每种组方药物对6,7-二甲氧基香豆素药代动力学行为均起不同的作用,这些作用均在一定层次和环节上贡献了茵陈蒿汤配伍用药的独特优势(图3和4)。同时,也只有在全方的条件下,茵陈蒿汤才能使CCL4导致的大鼠代谢紊乱得以调整,使尿液代谢组轮廓向正常回调,生物标记物甘氨胆酸的轨迹趋于正常。1.2特殊成分—六味地黄丸血清药物化学研究六味地黄丸始载于宋代钱乙《小儿药证直诀》,由地黄、山茱萸、山药、丹皮、茯苓、泽泻六味中药组成,主治小儿“五迟”、“五软”等肾阴不足症。大鼠灌胃给药后,从其血清中分析表征或鉴定了11个化合物。其中1号峰引人注目,该峰代表的化合物在体外微量存在,但口服后确在血清中含量极高。经分析此化合物的出现是药物与人体以及药物间相互协同作用的结果。它来自于地黄、山茱萸及泽泻3味生药共同代谢而产生,经鉴定为5-羟甲基-2-糠酸。该化合物具有较强的抗衰老、改善血液流变活性,与六味地黄丸补肾作用相关。加之,该成分在体内维持了12h的高浓度,也表明其有成为该方剂代表成分的可能。进一步的补肾作用研究显示,以上11个化合物均展现了积极的作用,其中来源于山茱萸及丹皮的原型物质及其相关的代谢产物活性最优。利用代谢组学方法研究健康人群口服六味地黄丸后代谢网络的改变,发现六味地黄丸调节有关的主要代谢途径包括三羧酸循环、肠小生物群、唾液酸生物合成,从一个新的角度阐明了六味地黄丸的传统作用机制,并从生物体代谢角度首次揭示了六味地黄丸的某些潜在作用机制(图6)。此外,进行六味地黄丸及其类方知柏地黄丸和桂附地黄丸的血中移行成分的比较研究,发现六味地黄丸及类方共同出现14个血中移行成分,知柏地黄丸产生了5个特有血中移行成分,桂附地黄丸产生了2个特有血中移行成分。而且,黄柏和知母的体内行为与其单味药的体内行为出现了相当大的差别,单味药口服未吸收的成分在口服方剂的血清中出现。相反,在单味药口服吸收的成分在口服方剂的血清中却未检出。可见,中药单味药谈不上确定的有效成分,何为有效成分只有在具体方剂中才能说清楚。3药代动力学研究药物代谢组学是以代谢组学的方法表征影响内源性代谢产物轮廓、指纹及轨迹的所有外源性物质及代谢产物的应用学科。中药血清药物化学是中药药物代谢组学的具体实践形式,它能全息性表征中药或方剂体内成分轮廓(globalprofileofTCMsinvivo)及含药血清指纹(fingerprintsofserumcontainingdrug),表征口服中药后血中成分的ADME特点,阐释体内直接作用物质间的相互关系,在鉴定中药或方剂效应成分及PK标记物、诠释方剂配伍规律、发现候选药