代谢组学的研究体系及其在系统生物学中的应用

代谢组学的研究体系及其在系统生物学中的应用

1代谢组学的提出geno是指特定生物的所有dna。基因组学是一项科学地研究生物的整个组织。转录物组(transcriptome)是指某一生物或细胞所有基因表达的RNA;转录物组学是一门对某一生物或细胞所有基因表达的RNA(如mRNA)进行全面分析的科学。蛋白质组(proteome)是指某一生物或细胞在各种不同环境条件下表达的所有蛋白质;蛋白质组学是一门对某一生物或细胞在各种不同环境条件下表达的所有蛋白质进行定性和定量分析的科学。转录组学和蛋白质组学是分别在基因的转录和转录后的蛋白质翻译与修饰两个水平上,研究基因的功能。代谢组学相对于其它组学而言还是一门较新的组学,不过已经显示了其在药物发现过程中的巨大潜力,它可以在药物发现过程的前期就能识别药物的毒性,避免了药物发现过程中的损耗。代谢组学研究有希望成为新药发现与研发过程的一个必需部分。代谢组学作为一门新发展的技术,它是通过考察生物体系受刺激或扰动后(如将某个特定的基因变异或环境变化后)其代谢产物的变化或其随时间的变化,来研究生物体系的代谢途径的一种技术。最初人们提出了代谢物组(metabolome)的概念,严格地说,代谢物组应该是指某一生物或细胞所有的代谢产物(metabolite)。在实际工作中,由于分析手段的局限性,更多的人倾向于把代谢物组局限于某一生物或细胞中所有的低分子量代谢产物。与基因组学、转录组学和蛋白质组学相对应,即代谢物组学是一门对某一生物或细胞所有低分子量代谢产物进行定性和定量分析,以监测活细胞中化学变化的科学。在人们逐步的研究过程中,提出了一些相关概念,如代谢物靶目标分析(metabolitetargetanalysis),代谢轮廓(谱)分析(metabolicprofilinganalysis),代谢组学(metabonomics)或代谢物组学(metabolomics),代谢指纹分析(metabolicfingerprintinganalysis)。其中,metabolomics和metabonomics分别从metabolome和metabonome演化而来,metabolomics最早出现在Fiehn小组的工作中,Fiehn研究小组主要研究植物生理代谢网络,其分析技术主要以GC-MS为主,也利用NMR和MS技术;而metabonomics由Nicholson率先提出,主要利用核磁共振手段分析动物体的代谢过程。因此有人提出以分析手段来区分metabolomics和metabonomics,目前国内的代谢组学研究小组基本达成共识,即用metabonomics一词来表示“代谢组学”。2后基因组学与代谢组学人基因组计划的基本完成,表明后基因组时代的到来,生命科学的主要任务是基因组功能分析。有人估计认识其功能比认识其结构任务更艰巨,花时间更长(50年或更长),核心思想是整体性研究——以生物体内某一物质分子整体为对象的研究。近年来,人类基因组测序工作的完成,迎来了后基因时代。人们对生命过程的理解有了很大的提高,研究的热点转移到基因的功能和几个“组学”研究,包括研究RNA转录过程的转录组学、研究某个过程中所有蛋白及其功能的蛋白组学、研究代谢产物的变化及代谢途径的代谢组学。遗传信息由基因经转录物向功能蛋白质传递,基因功能由其表达产物来体现。继基因组后,转录物组、蛋白质组出现,并相应形成“-omics”学说,如转录物组学(transcriptomics)、蛋白质组学(proteomics)等。但是基因与功能的关系,还不能用转录物组、蛋白质组来表达生物体的全部功能,于是出现代谢物组学和代谢组学。以基因、mRNA、蛋白质、代谢产物为研究对象的基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学,自然也是一个有机的整体,它们都是系统生物学特别是分子系统生物学研究的重要组成部分,系统生物学是后基因组研究最具挑战性的一个研究领域。后基因组时代,代谢组学的出现,特别在药物安全性研究中的应用,认为该新兴的学科分支会对药物安全性研究产生革命性的影响。面对风险的挑战,国外大制药公司:施贵宝(Bristol-Meyers-Squibb),礼来(Elililly),哈弗曼-罗氏(Hoffmann-LaRoche),诺瓦迪(NovoNordisk),辉瑞(Pfizer),法马西亚(Pharmacia)和帝国理工学院(ImperialCollege,London),应用代谢组学评价药物毒性,进行后选药物的临床前毒性筛选,进而对广泛模型化合物评价和安全性预测(3年中在大鼠和小鼠的尿的NMR分析研究了150个肝肾毒性模型)。他们的研究成果引起人们的关注,为发展这一新兴学科增添了力量。代谢组是反应机体状况的分子集合,所有对机体健康影响的因素均可反映在代谢组(metabonome)中,基因、环境、营养、药物(外源物)和时间(年龄)最终通过代谢组对表达施加影响。代谢组也是评价健康和治疗的合适的分子集合,因此研究代谢组学对药物治疗有直接意义。代谢组学是后基因时代的一门新兴的独立学科(2000年以后,发表的论文也不足100篇),该学科的应用跨越生物技术和医药技术,具有广泛发展前景。它与药物的药效和毒性筛选及评价研究、作用机制研究和治疗合理用药密切相关。3代谢组学系统生物代谢的检测是生物组基因组学和蛋白质组学——药物靶位发现和鉴别,组合化学——满足大量化合物的需要,高通量筛选——分子和细胞水平,生物活性快速评价,代谢物组学——新的评价系统,安全性和药效评价。代谢物组——生物体内小分子代谢物的总和,为基因表达和代谢形成的中间产物和最终产物。代谢组学测定的对象是生物标本——生物体液(如血液、尿等)、细胞提取物、细胞培养液和组织等。测定代谢物变化——研究系统生化谱和功能调节,应用代谢组信息——进行生物信息、化学计量学、统计学分析发现其内在的联系。4nmr的测定方法方法思路与基因组学相似,代谢组学研究细胞或生物样品的所有代谢的综合表现——全局观点,在研究方法上,代谢组学与其他基因组学不同之处,如在样本采集和处理上,方法简单,测定快速,并能进行动态连续研究。它虽然是一年轻的学科,但分析方法成熟,适于定性定量(HPLC,MS,NMR),实现与功能的联系,通过(与药效、毒性)比较、验证,所得结果容易与传统方法所得结果联系。代谢组学通常采用绘图技术,现代分析测定方法(NMR,HPLC,MS)绘制代谢物组图,应用计算机技术和统计方法,完成“指纹图谱”(fingerprint),以高通量的实验和大规模的计算为特征。其中NMR在药物代谢物组学研究中,显示出极高的地位。它具有图谱可测出信息量大的特点,人体尿液的1H-NMR谱中包含几百个甚至上千个化合物的信息。涉及数学分析、计算机应用、模型建立和仿真等诸多方面的研究内容。NMR谱中的化学位移、峰面积、偶合常数、驰豫时间均是解析化合物结构的依据,这使得NMR法成为目前代谢研究关注的一种方法。1H-NMR谱测定时样品用量少,一般0.3ml,一维谱的测定仅需5min,为一快速、简便的方法。与色谱法比较,突出的优点是对生物样品的预处理简单,这使得NMR法更具实用性,NMR谱的无损伤特点还使其可以检测整体动物或人体特定器官细胞内的代谢物组。然而由于代谢物的分子小,在数以千计的化合物中,大量的内源性物质,如肌酸酐、马尿酸、蛋白质。1H-NMR的化学位移范围只有10ppm,因此在3~5ppm和6~8ppm处存在大量的氨基酸,图谱中可能出现上百个化合物的峰,这些峰相互重叠、干扰,造成了图谱解析的困难,生物标物(biomarker)常常受到与测定不相关物质的干扰,因此一般NMR就难以发挥其作用。高分辨核磁共振(high-resolutionNMR)则成为强有力的武器。采用高分辨核磁共振仪,因其具有较好的灵敏度,信号分散,使图谱容易解析,可检测的核素有1H、13C、15N、19F、23Na、31P和39K等。大多数药物都含有质子,因此最常用1H-NMR。而13C、15N可用来跟踪标记的糖、氨基酸、脂肪、内源性小分子或药物等在体内的代谢物组,配合二维的1H-1HCOSY谱可提供大量有用的信息,并且可以简化图谱。采用分散系数编辑的图谱中,还可以看到乳酸、肌肝酸、丙氨酸、β-羟基丁酸、缬氨酸、胆碱类、脂蛋白等,以及用高分辨750MHz1H-NMR,采用自旋-回波、二维J-调制和同核、异核(1H-13C)相关谱研究血浆代谢物组。Fiehn研究小组的一系列有关植物代谢网络的研究比较有代表性,他们用GC/MS方法对模板植物拟南芥的叶子提取物进行了研究,定量分析了326个化合物,并确定其中部分化合物的结构。Nicholson等人在长期研究生物体液的基础上提出的基于NMR方法的代谢组学,则是定量研究有机体对由病理生理刺激或遗传变异引起的、与时间相关的多参数代谢应答,它主要利用核磁共振技术和模式识别方法对生物体液和组织进行系统测量和分析,对完整的生物体(而不是单个细胞)中随时间改变的代谢物进行动态跟踪检测、定量和分类,然后将这些代谢信息与病理生理过程中的生物学事件关联起来,从而确定发生这些变化的靶器官和作用位点,进而确定相关的生物标志物。除了GC-MS和NMR之外,HPLC和LC/TOF-MS也被用于这方面的研究。与MS和HPLC相比,NMR的缺点是灵敏度较低,但其优点也是非常明显的。NMR方法具有无损伤性,不会破坏样品的结构和性质,可在接近生理条件下进行实验,可在一定的温度和缓冲液范围内选择实验条件;可以进行实时和动态的检测;可设计多种编辑手段,实验方法灵活多样。NMR还有一个重要的特点,就是没有偏向性,对所有化合物的灵敏度是一样的,而MS则存在离子化程度和基质干扰等问题。因此,NMR方法很适合研究代谢产物中的复杂成分。其实,NMR氢谱很早就被用于研究生物体液,从一维高分辨1H谱图可得到代谢物成分图谱,即代谢指纹图谱。对1HNMR谱图以0.04ppm为单位,将谱图划分成若干区域,并对所有区域进行积分,然后将积分值归一化后输出。在得到了这些数据之后,就可以利用模式识别(patternrecognition,PR)方法来处理和分析这些数据,获得有价值的生物学信息,见图2。在代谢组学的研究中,最简单常用也是比较有效的模式识别方法是主成分分析法(principalcomponentanalysis,PCA)。PCA的特点是将分散在一组变量上的信息集中到某几个综合指标即主成分(principalcomponent,PC)上,利用这些主成分来描述数据集内部结构,实际上也起着数据降维的作用。主成分是由原始变量按一定的权重经线性组合而成的新变量,这些变量具有以下性质:①任意两个主成分之间都是正交的;②第一个主成分包含了数据集的绝大部分方差,第二个主成分则次之,依次类推。这样,由前两个或三个主成分作图,就能够很好地反映数据集所包含的生物化学变化。这样的主成分图能够直观地描述药物作用到器官之后,或者基因改变之后生物体内的代谢模式的变化。每一个样本在主成分图上的位置纯粹由它的代谢反应所决定,在这种比较简单的方法中,将从受试动物得到的样本与NMR产生的代谢组数据库进行比较,就可以确定它在主成分图上的位置,从而确定其机理,并有可能找到生物标志物。处于相似病理生理状态的动物得到的样本通常具有相似的组分,因此在主成分图中也处于相似的位置,许多代谢物之间的相关性无令人满意的结果,因此需要发展或采用更复杂的分析方法。另外,一些环境因素和性别、饮食等因素都会影响分析结果,因此,需要采用滤噪技术,如正交信号校正(orthogonalsignalcorrection),同时采用更为复杂的分析方法,如偏最小二乘法、判别分析(PLS-DA)和人工神经网络。用这类方法可以建立复杂的数学模型,对未知样本进行预测分析。NMR样品只需要简单的预处理,尿液和血清是代谢组学研究中的主要样品。对于尿样,需要通过离心除去固体悬浮物质,然后加入磷酸盐缓冲溶液,保证所有样品的pH值都在一个很小的范围内,这样才能保证所得到的谱图中相同化合物的谱峰在相同的位置。对于尿样,常用的实验方法是1D1H谱,通常采用加预饱和的1DNOESY脉冲序列,这样可以得到较好的水峰抑制效果和较平直的基线。同时采用较高的数字分辨率和较长的驰豫延迟,以保证能够区分化学位移相近的谱峰,且能够得到准确的积分。而对于血清样品,则需要采用驰豫编辑或扩散编辑的方法来分别观测小分子和大分子的谱峰。随着NMR技术的发展,以前用于固体的魔角旋转(MAS)技术被移植到液体领域,使得我们可以研究以前难以用液体NMR研究的样品,如器官组织样品。利用MAS技术,我们可以得到完整的组织样品的高分辨谱图,扩展了代谢组学研究的样品范围,同时可以更全面地对一个系统进行深入的研究。5代谢组学研究新药发现和开发领域中基因组学和蛋白质组学等新技术的应用,发展并推进了药物作用靶位或受体的发现和鉴别。组合化学提供的大量化合物以及从天然产物提取的大量样品,为建立高通量筛选提供了在细胞和分子水平评价筛选化合物,发现新的生物活性物质。但从整体观念来看,新药的发现最终必须在整体动物的药理和疾病模型上予以证实,才能将生物活性化合物转化为候选化合物进入开发研究。代谢组学作为一种系统方法,能在鉴别和确证药理和疾病模型上发挥作用。成功的疾病治疗必须使代谢网络中的缺陷部分正常化,同时又不得干扰其它维持健康所必须的代谢途径的调控。新药发现和开发的目的就是要从中获得能使代谢平衡由疾病状态恢复到正常状态(即药效研究的目的),而不是出现病理状态(即应该降低或消除的不良反应或毒性)。代谢组学研究可以区别不同种属、不同品系动物模型的代谢状态,鉴别与人体疾病状态的差异,寻找人类疾病、药效和毒性的适宜动物模型。在用动物实验的结果,或细胞水平的实验结果预测人的实验结果,生物标志物起着桥梁的作用。Aardema等认为具有以下关系,见图3。对于实验动物模型所得到的反映毒性的关键基因表达指纹与人有高度的相似性,表明发生在动物模型的分子损伤和效应与人相似。6生物代谢组学研究如前所述,代谢组学作为一种系统方法,能在鉴别和确证药理和疾病模型上发挥作用。成功的疾病治疗必须使代谢网络中的缺陷部分正常化,同时又不得干扰其他维持健康所必须代谢途径的调控。药物的作用机制的研究就是研究药物在这种调控作用中所起的作用和如何起作用。代谢组学研究“代谢指纹图谱”,它不仅研究药物本身的代谢变化,而且主要是研究药物引起的内源性代谢物的变化,更直接反映体内生物化学过程和状态的变化。通过认识体液“代谢指纹图谱”变化的原因,阐明药物作用靶点或受体。受体学说已经成为现代医学科学的重要理论,它是说明细胞如何识别、接受和传递信息的学说。象人体这样复杂的多细胞系统,有赖于遗传信息和神经及体液因素的正常传递,而这种信息传递在相当程度上依赖于各种受体。从药物学角度看,则依据药物分子与受体分子之间的反应规律,在药物分子结构和效应的关系基础上,发现新药并最终使新药具有更好的疗效和更少的毒性和副作用。利用代谢组学研究磷酸二酯酶IV抑制剂CI-1018形成的血管损伤与炎症反应的关系,发现该化合物引起的尿代谢物组图谱改变是血管损伤造成的,而与炎症反应无关。又如抗糖尿病药物罗格列酮对脂质代谢物组的影响的实验中,发现其作用机制是抑制动物肝脏-血液的脂交换。从成功的实例不难看出,用代谢组学方法研究所揭示的生物化学变化很容易与传统手段的测定结果联系,更容易评价药效作用和发现药物作用的生物化学物质基础和作用机制。比较两种抗抑郁药物(氯氮平和奎的平)的生物化学机制研究中,应用代谢组学方法,采用HPLC测定给药动物血清中多种内源性神经递质(Ach,DA,NE,5-TH等)的动态变化,而不是测定药物有效成分的变化进行该项目研究。7代谢组学对中药作用的认识中药多成分、多靶点和作用的多样性,给其作用机制研究、安全性研究和传统理论与现代医学理论的结合认识,以及中医治疗疾病的整体观念的理解等具有相当的困难。而代谢组学是反应机体状况的分子集合与其功能之间的关系,所有对机体健康影响的因素均可反映在代谢组中,基因、环境、营养、药物(外源物)和时间(年龄)最终通过代谢组对表达施加影响,即代谢组学具有明显的整体反应性的特点。这一特点与中医治疗疾病的整体观念十分吻合。因此认为应用代谢组学方法研究中药的作用物质基础、作用机制,甚至安全性都是值得探索的。根据受体学说,在研究由勾藤等多味中药组成的多动合剂的生物化学机制,从代谢物组成分和含量的经时变化发现具有疗效的生物标志物,认为药物的整体作用产生的生物化学物质(神经递质)是其药效的基础物质,证明这种药物的作用机制与DA受体有关。在研究参麦注射液的作用物质基础时,发现该中药能够激发机体形成洋地黄样的多肽物质,该物质与洋地黄样作用,是缓解心衰的物质基础。应用最新的具有反应整体思想的代谢物组学研究中草药的肾毒性,对中草药毒性进行科学的、综合的评价研究,以现代标准认识中草药毒性,对于确保中药的合理、安全、有效用药,建立现代中药的药理毒理评价体系,指导临床拟订合理的临床用药方案、剂量和时间均有理论意义和实用价值。这种利用最新学说发展成就试探中药的现代研究的思路,对提高我国中药研究水平也是值得提倡的。8基于nmr的毒性评价技术研究临床前安全性评价的目的是提供新药对人类健康危害程度的科学依据,预测上市新药对人类健康的危害程度。药物毒理学的目的是观察和测定化学物质对机体引起的损害,而在研究中能够提供更多重要信息的,是毒性病理学的研究。毒性病理检查能够判定药物造成病理性损伤的部位、程度、性质和预后等基本问题,因而可为药物的安全性提供重要的依据。在毒理学研究中大部分实验要进行动物试验,无论是急性毒性试验、长期毒性试验、致畸试验、致癌试验等病变的发现,部位的确定,病因的探索,都离不开毒性病理学的检查和诊断。试验的周期越长,毒性病理学检查的结果就越重要。用新技术新方法进行毒性机理的研究,是国际上一个重要的发展趋势。安全性评价必须在保证检测数据的可靠性的同时,引进先进的分子生物学等新技术和新方法,深入地进行毒性机制的研究,提高安全性评价的技术分析水平。代谢组学已经作为一种独立的技术被广泛地应用于候选药物的毒性评价,还被几家制药公司纳入其药物研发方案中。许多生物化学、毒理学和临床化学的问题,都可以用基于高分辨1HNMR的代谢组学来加以阐述。从生物体液的1HNMR谱图可以得到大量的代谢物数据,并由此确定毒性的靶器官,推导出毒性的生化机理,发现损伤的发生、发展和消失过程中的生物标记物。Nicholson研究小组利用基于NMR的