参苓白术散对溃疡性结肠炎小鼠肠道调节性细胞免疫调节作用及机制研究

参苓白术散对溃疡性结肠炎小鼠肠道调节性细胞免疫调节作用及机制研究

溃疡性胃炎（iu）是一种非特异性炎症。目前,UC病因及发病机制不十分明确,临床常用糖皮质激素和5-氨基水杨酸类药物治疗溃疡性结肠炎,但此类药物存在严重副作用。新近研究发现,CD4+CD25+T细胞(regulatoryTcell,Treg)在机体的免疫调节中具有重要作用,其数量缺乏或功能缺陷可直接引起人和动物多种自身免疫性疾病。据报道,参苓白术散以其有效的治疗效果和较少的副作用被广泛应用于溃疡性结肠炎的治疗,然而目前对于其具体机制的研究并不明了。本实验建立TNBS诱导小鼠结肠炎模型,应用参苓白术散进行治疗,揭示Treg在UC小鼠肠道中的变化规律,探索参苓白术散对UC的作用机制。1材料和方法1.1实验动物中心昆明小鼠,雄性,60只,体质量18~22g,由河北省实验动物中心提供。动物许可证编号为SCXK(冀)2008-1-003。1.2tnbs和t-对p3抗体检测参苓白术散购于山西华康药业股份有限公司,国药准字Z14020346。地塞米松购于武汉远大制药集团有限公司。TNBS购于Sigma公司;大鼠抗小鼠PE/Cy5-CD4、PE-CD25、AlexaFluor(2)488-Foxp3抗体,Biolegend公司产品;Foxp3固定破膜试剂盒,eBioseienee公司产品。1.3小鼠肠道调节性t细胞比例的检测实验分为正常对照组,TNBS模型组,参苓白术散高剂量组,参苓白术散中剂量组,参苓白术散低剂量组,地塞米松组。每组10只。除正常对照组外,乙醚麻醉小鼠,用直径为1mm的聚乙烯导管从肛门插入肠道约3cm,缓慢注入TNBS/乙醇溶液0.1mL(3mg/mL,40%乙醇)。小鼠被倒置1min以确保TNBS/乙醇溶液能在肠道均匀分布。给药后6h,正常对照组和TN-BS模型组灌胃0.2mL生理盐水,每天1次;地塞米松组在造模后1、3、5、7、9d给予地塞米松(1mg/kg,皮下注射),参苓白术散溶解于生理盐水中,参苓白术散低、中、高剂量组按照0.2mL药液体积灌胃,药物质量浓度分别为140、280、560mg/mL。连续用药10d,造模第11天,处死小鼠。在冰浴条件下取结肠,测定结肠长度;取肠系膜淋巴结,测定调节性T细胞比例;结肠液氮速冻后转入-80℃保存,以备检测结肠匀浆细胞因子水平。1.4测量的长度1.5荧光标记岩石细胞的制备取小鼠肠系膜淋巴结,PBS缓冲液冲洗两遍,5mL注射器针芯研磨肠系膜淋巴结,300目尼龙布过滤,260×g离心5min收集细胞。调整肠系膜淋巴细胞密度为5×106个/mL,取出100μL,在每个流式上样管中加入100μL准备好的细胞悬液,细胞数约为5×105个。标记抗小鼠PE/Cy5-CD4、PE-CD25抗体,避光4℃孵育30min。用预冷的PBS洗涤细胞,旋涡震荡重悬细胞后加入1mL的固定/破膜工作液并再次旋涡混匀,避光4℃孵育30min。加入2mL破膜缓冲工作液离心洗涤细胞并弃去上清液,直接加入稀释好的荧光标记Foxp3抗体5μL,避光4℃孵育30min,加入4mL破膜缓冲工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。0.5mLPBS重悬细胞,上机检测并分析。1.6elisa法测定各组小鼠肠道组织匀浆水平磷酸钠缓冲液清洗结肠,处理后的结肠15000×g离心30min,收集上清,ELISA法测定肠组织匀浆上清TNF-α、IL-1β、IL-10水平。2统计学分析实验结果皆以ue0af±s表示,采用SPSS15.0统计软件包进行统计学分析。采用单因素方差分析(ANOVA),组间两两比较,采用最小显著差法检验,P<0.05为差异有显著性。3结果3.1各组小鼠结肠长度的比较与TNBS模型组比较,参苓白术散中剂量组能明显增加溃疡性结肠炎小鼠结肠长度(P<0.05),参苓白术散高剂量组及地塞米松组能显著升高小鼠结肠长度(P<0.01)(如表1)。此组数据显示了参苓白术散高剂量组在减轻溃疡性结肠炎病变程度的潜在作用。3.2各组大鼠肠道il-1、f-和tnf-表达水平的比较为检测参苓白术散能否通过降低肠道炎性细胞因子表达发挥肠黏膜保护作用,本实验检测肠道TNF-α和IL-1β水平,如表2所示,与模型组比较,参苓白术散高剂量组与地塞米松组能显著降低肠道IL-1β水平(P<0.01),参苓白术散高剂量组能显著降低肠道TNF-α表达(P<0.05)。提示参苓白术散可能通过降低肠道炎性细胞因子分泌减轻肠道损伤。3.3参茯苓白术散对小鼠肠道il-10、tgf-的影响有研究报道溃疡性结肠炎发病与免疫抑制性细胞因子IL-10和转化生长因子β(transforminggrowthfactorβ,TGF-β)降低有关,CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞通过产生IL-10和TGF-β减轻肠道炎症状态。因此,在这部分实验中,探索了参苓白术散治疗是否可以上调结肠组织匀浆中IL-10水平,是否可同时升高肠系膜淋巴结Treg细胞的比例。如表3所示,与正常对照组比较,TNBS模型组小鼠IL-10明显降低,而与模型组比较,参苓白术散高剂量组显著升高了肠道IL-10水平(P<0.01)。为探求参苓白术散是否通过调节Treg细胞的比例发挥治疗效应,我们检测了肠系膜淋巴结淋巴细胞CD4+CD25+Foxp3+T细胞与CD4+T比值。结果显示与模型组比较,参苓白术散高剂量组明显提高肠系膜CD4+CD25+Foxp3+T/CD4+T数值,见表3。4参茯苓白术散对资金供应的调节作用参苓白术散出自《太平惠民和剂局方》,被广泛应用于胃肠道疾病的治疗。虽然参苓白术散多年来应用于溃疡性结肠炎,但其具体机制仍不明了。一些研究认为其治疗作用与提高大鼠结肠组织SOD活性,降低MDA水平、降低结肠炎大鼠吞噬细胞膜糖蛋白及可溶性黏附分子P选择素有关。然而,参苓白术散与溃疡性结肠炎肠道调节性T细胞的关系尚未明了。本研究建立TNBS诱导小鼠结肠炎模型,应用参苓白术散进行治疗,研究显示参苓白术散高剂量组通过减轻TNBS诱导溃疡性结肠炎结肠长度缩短、降低肠黏膜炎性细胞因子表达、直接影响肠系膜Treg细胞比例与功能,调节肠道高炎症状态。IL-1β是炎性肠病进展的重要介质。IL-1β一方面作为抗炎因子介导UC急性期过程,在UC发生的初始阶段发挥重要活性,另一方面,它还可反馈性的促进巨噬细胞和T淋巴细胞产生IL-2,IFN-γ加速炎症反应。TNF-α主要由活化的单核巨噬细胞所产生,可使白细胞在炎症局部聚集,刺激单核细胞、血管内皮细胞等产生细胞因子,最终导致组织的损伤,在UC中被公认为是一种促炎细胞因子。在UC活动期,TNF-α水平升高能介导肠黏膜损伤作用。本实验中,溃疡性结肠炎小鼠肠道TNF-α与IL-1β水平均升高,增高的细胞因子与炎症细胞相互作用,加重局部肠黏膜的炎症损伤。经过参苓白术散治疗,减轻了TNF-α、IL-1β与炎症细胞相互作用,减轻局部肠黏膜的炎症损伤,从而促进肠黏膜修复与溃疡愈合。CD4+CD25+Treg对溃疡性结肠炎有预防和治疗作用,其功能异常或数量减少均可导致自身免疫性疾病发生。有效升高Treg比例和加强其功能已经成为结肠炎免疫治疗的新策略。实验结果显示参苓白术散高剂量组明显升高肠系膜淋巴结Treg细胞比例,说明参苓白术散可能通过提高肠道Treg数量发挥肠道黏膜保护作用。调节性Treg主要通过分泌IL-10和TGF-β发挥免疫调节作用。研究表明,由Treg诱导的IL-10升高是结肠炎治疗的有效手段。本实验研究结果显示,与正常组比较,TNBS模型组小鼠肠道IL-10水平明显降低,其趋势与Treg细胞一致,经参苓白术散治疗后,肠道IL-10水平水平显著提高。进一步加强了参苓白术散通过调节肠道黏膜Treg及相关细胞因子IL-10发挥黏膜保护作用的假设。同时,这也解释了为