浅谈宏转录组学在遗传调控中的应用

浅谈宏转录组学在遗传调控中的应用

自然界中的微生物多样性非常复杂。大多数微生物无法通过传统的纯培养方法在培养基中的培养和分离。研究显示,只有1%～5%的微生物可以在实验室实现纯培养。因此,在过去的300多年中,大多数微生物不能通过传统的、已经设计好的实验方案进行研究。随着分子生态学方法的建立,科学家们对环境微生物的整体情况有了较深刻的了解。最初,研究人员采用基于16S/18SrRNA/rDNA的变性梯度凝胶电泳(Denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)和克隆文库的方法对反刍动物肠道微生物群落的变化情况进行监控,随后荧光原位杂交(Fluorescentinsituhybridization,FISH)和限制性片段长度多态性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)等技术的建立和应用,使人们对微生物群落有了更加深入的了解。20世纪兴起的宏基因组学(metagenomics)通过大规模的测序技术,能够直接得到某一环境条件下微生物群落的整体结构信息,这在很大程度上解决了大部分微生物因不能分离培养而难于研究的问题,避免了其他固有技术(如PCR)应用中易出现的实验偏差,同时也免去了一些费时耗力的实验步骤比如文库构建。但是,该技术仍无法对微生物群落结构及代谢、功能间的关系进行剖析和监测,特别是无法明确微生物适应环境变化而做出的响应。宏转录组学(meta-transcriptomics)是在宏基因组学之后兴起的一门新学科,研究特定环境、特定时期群体细胞在某功能状态下转录的所有RNA(包括mRNA和非编码RNA)的类型及拷贝数。这种技术不但具有宏基因组技术的的全部优点,而且能将特定条件下的生物群落及其功能联系到一起,对群体整体进行各种相关功能的研究。新一代测序方法的产生直接扩大了宏基因组研究的数量和范围,并且推动了宏转录组学的建立和发展。454焦磷酸测序法是新一代的测序技术,它能够对DNA或者cDNA直接进行测序,省去了克隆的步骤,增加了测序产量,而且降低了每个测序碱基的成本。Leininger等第一个使用454测序技术对一个复杂微生物群落的宏转录组进行研究发现与土壤中的其他细菌相比较,古菌胺氧化关键酶(amoA)的转录本能够保持相当高的丰度,这体现了古菌在土壤胺氧化微生物中的数量优势。该转录组学研究所获得的25Mbp的序列由Urich等做了进一步的分析。2008年,Friaz-Lopez等通过该测序法获得了>50Mbp的测序长度。第二代GS-FLX测序技术具有分析结果准确、快速、高灵敏度和高自动化的特点,在技术的成熟性和性能方面也均远远超越了第一代,用此技术Gilbert获得了300Mb的序列数据。最近报道的454FLXTitanium平台,其测序的平均长度大约为400bp,并且可以预测,未来其读取长度可以和那些传统测序技术相媲美。随着大规模测序工作的迅速开展,出现了各种生物信息学数据库,应用于大规模微生物的基因组序列分析。这些数据库之间联系密切,并借助于网络形成了复合的、开放型的多功能数据库系统。这些新型数据库系统还整合了多种数据分析软件,为使用者提供了方便。另外,大量基因注释工作的完成极大丰富了数据的信息量。可以预见,当基因组测序及注释工作基本完成以后,积累的大量数据将使生物信息学在人类基因组研究中的重要性更加突出,为宏转录组和宏基因组技术的发展,提供有利的新途径。1提取纳米na宏转录组学研究方法通常含有五个步骤(图1),其中群体RNA的处理及数据的比较分析是较为关键的两步。由于RNA的稳定性要比DNA差的多,有些转录组样品的放置时间不能超过一分钟,因此必须采取一些有效的措施以防止RNA的降解,比如立即速冻或者放置于RNA储存液当中,并尽快完成反转录。另外,在一个细菌细胞的总RNA中,mRNA仅仅占1%～5%,这就需要在提取之后进行mRNA的富集。虽然不经过富集的mRNA样品也能够通过焦磷酸测序进行群落结构的分析,但如果主要的目的是研究群落的转录谱,如此的测序量便是一种浪费。现在已有可用于mRNA富集的商业化试剂盒。比如,使用Ambion的MICROBExpress试剂盒,其去除rRNA后的样品经反转录产生的cDNA中rRNA的数据比例<20%,或低于0.08%。另一个重要的步骤是数据分析。数据库的发展是宏转录组分析的重要影响因素,常用的宏基因组、宏转录组和宏蛋白质组研究的数据库和软件列于表1。2资源和优势2.1实验结果的比较在过去几十年中,大量的转录组测序已经完成,它们回答了药物学与生物学中许多关键性的问题,并且为解释某些抗冲击表型,比如抗紫外线、抗热击等相关基因的表达提供了有价值的依据。这些转录组序列信息的获得大多数是应用DNA芯片技术来完成的。起初,这些研究仅限于单个纯培养的生物体,后来扩大到包含几种生物的小群落。以DNA芯片为基础构建的表达谱能够包含一定量的信息,但是芯片的制作需要基因或全基因组序列有相应的注释。这就降低了从环境中获得新的功能的蛋白的可能性。相比较之下,宏转录组研究的样品可以包括许多种类的生物,而且得到的mRNA序列大多数是未知的,结果分析也不需要已知基因注释,因此宏转录组对于发现新种类的蛋白质具有非常大的潜力。与宏基因组相比,转录组需要的测序容量较小。在检测的灵敏度和定量的可靠性方面也比较好,这些特点尤其适合于研究低编码密度真核生物基因组。2.2群落分类的影响宏转录组的数据包括rRNA和mRNA,这样就可以对样品中微生物群落结构和原位功能进行解释。将其微生物群体复杂的群落分类与它们的功能相关联,可以利用这一特点有效地监控由环境引起的群落结构和功能的变化。比如,Urich等使用该方法首次得到了自然状态下群落活动的整体数据,实现了三个域的生物成员丰度的同步定量评估,同时,他们也检测到了丰富的mRNA,从mRNA中得到群落生理代谢的情况,并进一步分析了样品中各个群落组成成分的功能。3在微生物生态学研究中的应用3.1土壤微生物物种多样性与基因序列及生物活性关系采用宏转录组学的方法研究环境微生物的多样性及相关功能,可以发现大量的微生物资源,研究种群结构多样性及各种因素对其代谢的影响,解密复杂的微生物环境,如土壤、海洋等样品中信号分子的传递和基因调控机制,从而为探索微生物群落的生态功能奠定基础,表2归纳了部分微生物宏转录组的研究概况。续表Urich等在研究沙质土壤生态系统中微生物群落时,采用宏转录组的方法获得了2.1MbpmRNA-tags,并用SEED数据库进行了全面的功能分析。将分别来自于相同土壤和不同农场的土壤的宏转录组与宏基因组数据相比较。由系统相对分布得知,两种土壤样品的宏基因组功能分析结果非常相似。宏基因组分析经常通过将编码蛋白质的基因与已测序的相关基因组比对进行群体分类,得到群落分类的概况。这说明,土壤微生物群落的功能具有普遍相似性,因此以DNA为基础的土壤群落功能分析可能总是得到相似的结果。而宏转录组得到的rRNA和mRNA数据却能够检测群落变化的过程。当把rRNA概况与包含mRNA-tags的分类学库用MEGAN比较,发现有5种主要细菌的种类发生了变化,并且蛋白质代谢(转录、翻译、蛋白质折叠和降解)能全部展示出来,作为预测生物体活动的指标。宏转录组和宏基因组之间更多的不同是:与宏基因组相比,宏转录组数据显示涉及单糖、寡糖、多糖和氨基糖有氧降解的蛋白质的转录水平降低,而与发酵、糖醇类和CO2固定相关的转录水平基本相同。以RíoTinto(西班牙)地区极端酸性水域的特点是营养贫瘠并且金属含量极高,以该水域中水气界面的微生物种群为研究对象进行研究,发现属于革兰氏阴性菌的钩端螺旋菌属、硫杆菌属和氧化亚铁硫杆菌属非常丰富,这些微生物组成了嗜酸的纤维生物膜,该纤维生物膜生物中的上调基因与生物膜的形成和稳定有关,如涉及运动型和群体感应(mqsR,cheAY,fliA,motAB),细胞壁结构合成(lnt,murA,murB),特殊蛋白酶(clpX/clpP),应激反应分子伴侣(clpB,clpC,grpE-dnaKJ,groESL)等的基因。另外,涉及混合酸发酵的基因(poxB,ackA)在生物膜中也有上调。在这种pH1.8的水域当中,同时也有小分子有机酸——醋酸盐和甲酸盐的存在(分别为1.36mmol/L和0.06mmol/L)。科学家们推测,醋酸在组成生物膜的变形菌纲,酸杆菌属(Acidobacteriumspp.)和硫化杆菌属(Sulfobacillusspp.)菌中向Fe3+提供电子,发挥其相关的生态学作用。另外,醋酸可能对于化能无机营养细菌的生长有抑制作用,从而对生物浸矿产生消极影响。该研究结果通过比较纤维生物膜中生物在极酸环境下的生理差异,使这些极端微生物在工业生物浸出和环境应用领域发挥相应的生物学作用。在2008年的一项关于土壤群落的宏转录组研究中,第一次提到了未能培养的泉古菌(Crenarchaeota)的原位活动。mRNA数据中古菌占1.7%,与rRNA数据中的比例是一致的。将超过80个mRNA-tags同源的序列在数据库中进行功能注释发现,除了典型古菌持家基因的转录产物之外,还涉及到丰富的氨氧化序列。有13个mRNA来自于代谢关键酶氨单氧化酶的转录产物(amoA和amoC)和来自于氨氧化还原酶(nirk)的转录产物。这说明,作为氨氧化细菌,无论是在好氧条件还是厌氧条件下,都参与了氨的氧化过程。这些发现再一次证明了氨氧化是土壤泉古菌的主要能量代谢方式。另外,还检测到与CO2代谢相关的乙酰辅酶A/丙酰辅酶A羧化酶mRNA存在。来自于甲基丙二酰辅酶A变位酶(MCM)的同源蛋白的mRNA,和来自于4-羟基丁酰辅酶A同源蛋白的mRNA,连同乙酰辅酶A/丙酰辅酶A羧化酶一起,组成嗜热古菌和海洋古菌中特定的CO2固定途径。这证明了土壤和海洋中古菌CO2的固定途径是相似的。这两组转录组数据很好的解释了这个很少被研究的群体的化能无机自养生活方式。Poretsky对贫瘠的北太平洋水域表面的浮游细菌种群进行了研究,mRNA数据表明,该群体的微生物白天进行光合作用、氧化磷酸化和C1化合物的合成代谢活动,而夜间则进行细胞膜,氨基酸和维生素等生物合成活动。Holmes等在2009年对铀污染环境中沉积物的宏转录组进行检测,并与没有污染的样品进行比较,发现有1084个基因的转录水平提高,同时在G.uraniireducens细胞中有34个涉及铀降解的基因上调。对该结果进行进一步分析,将来可以应用于对污染的环境的检测。Shi等用宏转录组技术对海洋样品中smallRNA的研究中发现,psRNA(putativesRNAs)分布于基因组中基因之间的区域,其二级结构非常保守。由于位于基因的两侧,推测这些psRNA可能与基因的功能调节有关。随深度而变化的psRNA能够反映分布广泛的群落分类情况;而联系紧密的群体的生态环境适应性,可以通过更精确的psRNA差异来证明。3.2海洋细菌和海胆上phna基因同源物的来源2009年,Gilbert应用宏转录组技术从海洋中获得总mRNA,并分析了其中复杂的环境转录组信息,对沿海生态系统中28个phnA基因的同源物质进行研究,结果显示>3%的海洋细菌携带有phnA基因。同时在fosmid文库中,发现了phnA同源物的存在。含有该同源物的微生物包括不能培养的用于氨氧化和碳固定的Crenarcheota,以及海洋中有固氮功能的CyanobacteriumCrocosphaerawatsonii。3.3amoc转录本的制备宏转录组学还可以用于特定复合基因的拼接,Leininger等采用非目标的随机引物反转录的方法,用mRNA-tags拼接出一个接近全长的amoC转录本。推导出的氨基酸序列包括了古菌海绵共生体的海绵共生体amoC同源体189个氨基酸中的146个(77%),并且与海绵共生体amoC同源体有88%的一致性,与amoA有84%的一致性。4浮游生物群落如前所述,宏转录组学能够广泛用于复杂群落的研究,像海洋浮游植物、地表水和土壤微生物群落等。随着新一代测序技术的发展以及基因注释的进一步丰富,宏转录组应用于微生物生态学研究的前景将更加广阔。4.1宏转录组对高丰度的转录表达基因的鉴定是现代研究发现的重点之一在生态系统研究中使用宏转录组学技术,能够对实验设计条件下基因表达的变化情况直接进行分析。尤其对于那些活性未知的生物群落的转录组学数据,从中能够获得一些知之甚少的微生物生态学信息。有的生态或者生物化学范围内的重要基因可能不存在于高丰度的转录群体中,例如,与中心代谢和蛋白质合成相关的基因的转录情况相比,环境中高含量化合物对于细菌转运表达基因的转录影响并不明显。因此,研究细胞的大量代谢——核糖体蛋白、DNA复制相关酶的生态信号的鉴定可以采用宏转录组进行深入测序。另外,随着测序技术的进步,mRNA序列的覆盖信息会进一步扩大,同时借助于基因芯片进行宏转录组的数据比较,通过基因的线性表达情况鉴定和研究复杂微生物群落的基因调节活动。4.2宏转录组学研究环境微生物在地球化学循环及一些特殊环境的形成中起着重要的作用,利用宏转录组技术,对那些仍然未知但是可能起着关键作用的基因进行研究,与特殊功能微生物群落结构联系到一起,便能深入理解其生物学本质。已知的宏基因组学研究公布了含有