转座子的功能与应用

转座子的功能与应用

又名跳轴，也被称为跳跃因子，它的实质是一个没有必要通过同源序列移动的dna段，并且可以直接从组合的某个点移动到另一个点。自1951年美国McClintock在玉米中首先发现了DNA转座子以来,转座子已成为各种生物基因分析的有效工具之一。不仅可利用转座子诱变找到原核生物的单性生殖基因,而且在真核生物中,转座子的发现和运用极大地促进了果蝇遗传学的发展。人们已经应用各种方法,在生物界各个领域证实了转座子系统的广泛存在。利用转座子特有的转座功能,将带有标记的转座子插入目的基因或基因组,产生了转座子标签技术、转座子定点杂交技术、转座子基因打靶技术和非病毒载体基因增补技术。人们利用这些技术,可以确定基因组的功能、基因组间的功能差异;可以改变目的基因的活性,获得转基因生物;可以阻断毒力基因,获得基因疫苗;可以促进基因整合,进行基因治疗等。转座子的发现改变了人们对基因组序列稳定性的认识,打破了遗传物质在染色体上呈线性固定排列的传统理论。转座子插入新的位点后,该位点附近的基因即受到抑制而呈现隐性的“睡美人”表型。一旦转座子在转座酶的作用下从这一位点上转走,该位点的基因隐性表型又恢复为显性表型,即“睡美人苏醒”。调控转座酶和转座子活性的系统称为“青蛙王子(FrogPrince)”。目前,认为多数生物体有自发突变且有重要表型效应出现都源于转座子的可动性,并且可以导致宿主基因组发生从点突变到染色体重排的一系列变化。转座子在进化上为建立宿主基因特性起着重要作用。用特异的开放阅读框捕获技术,可以使自然散在的转座酶编码基因高度表达,人为催化激活转座子使其“苏醒”,执行插入、黏贴、切除等任务。目前已经应用于微生物、昆虫、植物、动物及人类基因组功能的研究,例如蛙类基因组含有“水手”转座子超家族,呈自然失活状态,转座酶与转座增强子序列末端结合,在蛋白协助下,激活转座子,使睡美人转座子苏醒。1转向座子类型1.1不同的基因组dna转座子DNA转座子是以DNA-DNA方式转座的转座子,可通过DNA复制或直接切出2种方式获得可移动片段,重新插入基因组DNA中,导致基因的突变或重排,但一般不改变基因组的大小。根据转座的自主性,DNA转座子又分为自主转座子和非自主转座子,前者本身能够编码转座酶而进行转座,后者则要在自主转座子存在时才能实现转座。玉米的Ac/Ds体系就是典型转座因子,活化子Ac属于自主转座子,解离子Ds属于非自主转座子,只有在Ac存在时,Ds才能转座。1.2反转录转座子反转录转座子以DNA-RNA-DNA的途径来实现转座,反转录转座子在宿主基因组中的拷贝数得到不断积累,从而使基因组增大。由于反转录转座子带有增强子、启动子等调控元件,所以会影响宿主基因的表达。在生物进化过程中,反转录转座子起着不可忽视的作用。这类转座子是近年来发现的一种广泛存在于高等植物中可活动的遗传成分。根据是否具有编码反转录酶的能力,反转录转座子可分为2个家族:自主性反转录转座子和非自主性反转录转座子;按照序列结构中有无长末端重复序列(LTR)又可分为有LTR反转录转座子和无LTR反转录转座子。自主性反转录转座子包括内源性反转录病毒(ERV)、LTR反转录转座子及长散在元件(LINEs);非自主性反转录转座子包括短散在元件(SINEs)及修饰性反转录假基因。2董事会的特征和董事会机制2.1反向重复序列的检测无论是在原核生物还是在真核生物体中,转座子在结构上都有2个特点:转座子的两端分别有一个DNA倒置重复序列,称为末端反向重复序列,不同转座子系统该序列长度不同;在转座子重新整合的位点,转座子一侧有一个正向DNA重复序列,这些重复序列的长度也因不同的转座子系统而存在差异。2.2转座酶基因分子转座的机制实质就是DNA的扩增和重组。转座是生物进化的重要手段,对于转座的机制,长期以来形成了一种固定模式,即转座是通过反向转录酶的中介作用,以DNA为实体插入转座子的模式,其模式有2种:RNA→DNA→插入点;DNA→RNA→DNA→插入点。这种理论解释了长序列基因的转座,而对于大量的短片段的、亚基因的转座却是以RNA为中介的调控反应结果,又称为调控转座,即先有调控后有转座,转座是调控反应的结果。所以有学者认为,转座的实体应当是RNA,而不是DNA,并且不一定要通过反向转录酶为中介,转座子都具有编码与转座作用有关的酶-转座酶的基因,而末端大多数都是反向重复序列。转座酶既识别转座子的两个末端,也能与靶位点序列结合。转座作用的机制是转座子插到新的位点上产生交错切口,所形成的突出单链末端与转座子两端的反向重复序列相连,然后由DNA聚合酶填补缺口,DNA连接酶封闭切口,交错末端的产生与填补说明了靶DNA在插入位点存在正向重复,两条链上切口之间的交错取决于正向重复的长度。因此,每个转座子所特有的靶重复序列反映了切割靶DNA的酶的几何形状。3使用转向对象3.1寻找新基因，确定生物聚集功能3.1.1转座子突变体的确定和应用转座子具有可选择的抗性标记而容易在体内鉴定突变,经转座子诱变的突变子含有已知的DNA片段,可以通过转座子序列的杂交来鉴定突变基因的位置,经转座子诱变的突变体具有高度的极性,使得被诱变的基因以及同一操纵子内的下游基因完全丧失功能。正因为以上转座子的特征,转座子才被广泛应用于构建插入突变体库,现已成为研究基因功能的重要手段之一。目前研究和应用得较多的有Tn10、Tn5、Tn3和Mu噬菌体,其机制是所有转座子都携带其转座所必需的基因,因而转座作用不依赖于转座子和靶点之间以及供点和靶点之间任何的序列同源性。转座子插入后,插入或是妨碍了转录,或是妨碍了翻译,从而使靶点处的基因失活。而且插入往往表现出极性效应,即转座子在操纵子上游基因的插入影响到下游基因的表达,原因是转座子序列中含有终止子或终止密码子,造成转录或翻译终止,由此影响到后续基因的表达,进而依靠表型鉴定出突变体。目前转座子突变体已应用于生物体基因的鉴定,HudsonP等利用Tn4001mod转座子构建突变株,鉴定鸡败血支原体的毒力相关因子。TaeokBae等运用转座技术寻找葡萄球菌的毒力基因。构建突变体库的关键技术是转座子的选择。需要选择转座随机性好的转座子,例如之前大量研究证明Tn5转座子具有很好的转座随机性,但Jacobs等的研究结果仍然发现,该系列转座子在铜绿假单胞菌PAO1基因组中的转座插入采样数不符合泊松分布,但最终还是获得了一个近饱和的突变株库。而Garsin等在构建粪肠球菌的Tn917转座插入突变株库时发现,测序的8865个Tn917转座突变株突变基因只对应了610个不同的开放阅读框,远远低于预期的2400个。这些结果说明,使用随机性差的转座子会大大增加建库的成本。对突变基因测定方法采用随机引物PCR的方式,以达到自动化的目的。随机引物PCR采用机器自动化进行,使测序工作完全不需要人工的参与,达到省时省力的目的,从而使建库所耗时间和精力大大降低,这样可以由一个研究组完成而不需要大规模的协作。3.1.2ac/ds转座子生物学特点利用转座子标签法分离基因的优点:①转座子插入引起的突变会由于转座子的切离而回复。由于转座子的不断跳跃,一旦把转座子导入目标植物,如通过自交、杂交等手段,转座子Ac/Ds的番茄转化与转双价基因对提高番茄青枯病抗性的研究便可得到一个较大的含不同插入位点的转座子群体。②把转座子导入异源植物不受转化条件的限制。与T-DNA相比,Ac/Ds转座子不但对基因组小的植物是行之有效的,如拟南芥等,而且对水稻、小麦等基因组很大的植物也可以获得足够的插入突变体。③转座子产生的突变可以与表型共分离,可以产生恢复突变以检测突变是否插入。因此,在克隆、分离基因方面,转座子比T-DNA标签具有更大的潜力。3.2用座位法培育旋转动物3.2.1piagybac转座子研究亲缘关系较远的昆虫的转座子能够切出并发生转座,这为获得转基因动物提供了条件。目前,已成功获得的有转基因地中海果蝇、转基因黑腹果蝇、转基因家蚕。piggyBac转座子的准确切出总是伴随着转座,在转座时能够携带外源基因进入受体基因中,并且允许在新的基因组中表达。携带的基因没有大小限制,在地中海果蝇、黑腹果蝇、家蚕等3个亲缘关系较远的昆虫中,能作为一个高效、稳健的载体对基因转移,并促进生殖种系转化。3.2.2病毒载体转化斑马鱼转座子导入鱼类的研究主要集中在斑马鱼的研究。多年前,已利用显微注射技术成功制备出转基因斑马鱼,而且转基因实现了种系传递,但种系传递的效率只有0~20%,转基因的表达也不稳定。后来,利用假型反转录病毒作载体,可提高外源基因的转化效率和种系的传递效率,且已用于斑马鱼胚胎发生的相关基因的克隆和突变。据研究发现,mariner/Tc1家族的转座元件也可转化脊椎动物,如在秀丽线虫中发现的Tc3转座元件已成功转化斑马鱼。斑马鱼基因组插入转座子可迅速确定其必需基因.3.2.3缺乏有效的非病毒抑制剂系统近年来,禽蛋生物反应器以其自身的优势而逐渐成为新的研究热点,但制备转基因禽类尚缺少一种有效的、非病毒介导的基因转化系统,这使得该系统发展缓慢。据Roslin研究所的研发人员报道,一种利用mariner转座元件将外源基因高效导入鸡基因组的方法,提高了外源基因在鸡基因组的整合效率,展示了制备转基因禽类的发展前景。3.2.4小鼠和其他脏器中转座子的应用过去,转座子元件只是在低等生物中进行转基因和插入突变研究,相反,由于缺乏一个有效的转座子系统,转座子在小鼠和其他脊椎动物中的应用受到限制。上海复旦大学发育生物学研究所的科研人员将一种源于飞蛾的PB转座子,用于小鼠和人类细胞的基因功能研究,他们发现PB转座因子可在人等哺乳动物的细胞株中高效导入基因并稳定表达,为体细胞遗传学的研究和基因表达提供了一个高效、便捷的新系统。3.3生长分析诊断工具转座子通常限制性地分布于特定的真菌菌株或群体中,可以作为特定菌株的诊断工具,已用于丝状真菌群体多样性分析。在医药工业方面已用于有益菌株的鉴别,在植物病理学方面已用于鉴别特定的病原。3.4促进微生物分解代谢由于基因的可变性及转座子的遗传调控,许多微生物能够利用人工合成的化学物质,与微生物分解代谢相关的基因往往与插入元件相连。当环境污染时,转座子转移频率提高,增加了微生物种群的生物降解潜力。3.5第二,基于双链tn5转座子检测细胞不良反应胚胎干细胞同源重组、基因突变定位已发展成为研究人类疾病动物模型的有效研究工具。干细胞的多向分化性结合“睡美人”转座子的定向点特异性修复能力,使基因修复且无需进行体外细胞培养治疗多种疾病称为可能。基于双链Tn5转座子插入的染色体缺失系统可用于少量基因组制备和必需基因的分析。Dupuy等用鼠胚