干扰素对大鼠胸主动脉平滑肌细胞内骨桥蛋白表达的影响

干扰素对大鼠胸主动脉平滑肌细胞内骨桥蛋白表达的影响

血管平滑肌细胞的过度增殖、增生和分化是动脉硬化和血管再狭窄的重要步骤。平滑肌细胞的形态特征与形态密切相关。根据结构和功能的不同,血管平滑肌细胞分为收缩与合成两种类型。由收缩表型向合成表型转化是血管平滑肌细胞增殖的必要条件。人们用差异显示的分子生物学技术对培养的血管平滑肌细胞表型转化基因标志的研究发现,骨桥蛋白在血管平滑肌细胞由收缩型转化为合成型的过程中占据了很重要的地位,是血管平滑肌细胞表型转化的标记基因。骨桥蛋白是细胞外基质中一种重要的功能性蛋白。近年来,骨桥蛋白作为一种机体反应蛋白,在抗炎和损伤修复过程中的重要作用逐渐引起人们的重视。骨桥蛋白基因表达具有组织细胞特异性,并且受多种激素、生长因子、肿瘤促进剂及原癌基因表达产物的调控。诸多生长因子和细胞因子也可调控骨桥蛋白基因的转录。在骨组织中IL-1α、TNF-α、1,25-(OH)2VitD3等均能刺激破骨细胞大量合成和分泌骨桥蛋白。在心血管系统中,一系列参与动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄的活性因子,如PDGF、bFGF、TGFβ、AngⅡ等均能刺激血管内皮细胞和平滑肌细胞表达骨桥蛋白分子。但目前国内外还未见报道IFN对平滑肌细胞内骨桥蛋白基因表达的影响,本实验以培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞为实验对象研究其对骨桥蛋白基因表达的影响,为进一步研究动脉粥样硬化的发病机制提供线索。材料和方法1.抗体和引物SD大鼠(上海瑞金医院实验动物中心),DMEM培养基(GIBCO公司),抗骨桥蛋白多克隆IgG抗体(SantaCruz公司),IFN-γ(晶美生物工程有限公司),兔抗山羊HRP(华美公司),引物(上海申友生物技术有限公司),dNTP、TaqDNA聚合酶、AMV反转录酶(Promega公司),ECL显色液(博彩公司)。2.dmem的检测选用8～10周龄雄性SD大鼠,取胸主动脉,应用贴片法培养基为含10%小牛血清的DMEM培养基,待平滑肌细胞长满培养瓶后,用0.25%胰蛋白酶消化传代,实验选用第6代细胞。3.细胞总rna提取当传代细胞生长至80%汇合时,加入不同浓度IFN-γ(50、500、1000、2000U/ml)继续培养24h,其中IFN-γ(1000U/ml)干预的细胞按时间再分为24、48h干预组,干预后按异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取细胞总RNA,以培养基内不加IFN-γ的细胞作对照。4.rt-pcr检测骨桥蛋白基因表达逆转录反应体系20μl:50mmol/LTris-HCl(pH8.3),50mmol/LKCl,10mmol/LMgCl2,10mmol/LDTT,0.25mmol/LSpermidine,1mmol/LdNTPs,0.2μgOligo(dT)15,20URnasin,10UAMV逆转录酶,1μgRNA,混匀离心。反应条件:42℃55min,95℃5min,立即冰浴5min后短暂离心。用于骨桥蛋白基因序列扩增的引物序列为:上游:5′CAAGGAGTATAAGCAGAGGGC3′,下游:5′CTCTTAGGGTCTAGGACTAGCTTGT3′,扩增片段长度200bp;β-肌动蛋白(β-actin)引物序列为:上游:5′GGTATGGGTCAGAAGGACTCC3′;下游:5′TGATCTTCATGGTGCTAGGAGCC3′,扩增片段为843bp;RT-PCR总反应体积50μl,0.5μgRNA的cDNA,2.5mmol/LMgCl2,10mmol/LTris-HCl,50mmol/LKCl,0.01%Gelatin,0.1%Triton-X100,0.2mmol/LdNTP,25μmol/L骨桥蛋白上下游引物各1μl或25μmol/Lβ-actin上下游引物各1μl。RT-PCR反应条件:94℃、5min后,94℃变性、1min,45℃退火、45s,72℃延伸、1min,再72℃延伸10min,扩增产物于2%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)进行电泳。结束后,于紫外灯下观察扩增结果,并进行图片光密度扫描。以骨桥蛋白与β-actin的电泳条带的光密度比值来作为骨桥蛋白mRNA的相对表达量。5.不同兔抗羊提取蛋白见文献,配10%分离胶与4%浓缩胶,各加20μg变性蛋白样品与5×上样缓冲液1∶6混合,置于5×Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3)中,冰浴中以80V电压电泳120min,再以0.08A电流持续转膜120min,然后用含脱脂奶粉封闭液封闭,37℃振摇2h后4℃过夜,第2天洗膜2次后加入1∶200抗骨桥蛋白抗体稀释液,37℃振摇2h,洗膜2次,加入1∶1000的兔抗山羊HRP抗体稀释液37℃振摇1h,滴1∶1ECL显色液于膜上,反应5min,压片15min,将胶片置于显影液和定影液各2min后观察。6.密度分析采用美国Kodak公司ID数码成像分析系统软件对RT-PCR及Western-blotting图片扫描进行半定量分析。7.统计处理全部实验数据采用均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,差异的显著性采用组间t检验,以P<0.05为差异有显著性。结果1.组白与-actin基因水平光密度比值比较对照组细胞表达一定量的骨桥蛋白基因(与β-actin基因水平光密度比值0.831±0.081),50和500U/mlIFN-γ干预组骨桥蛋白与β-actin基因水平光密度比值(分别为0.850±0.029,0.986±0.017)与对照组比较,差异无显著性。1000和2000U/mlIFN-γ干预组光密度比值(分别为1.034±0.029,1.089±0.059)分别较对照组提高了24.49%和31.02%,且差异有显著性。1000和2000U/mlIFN干预组相比差异无显著性。因此用浓度为1000U/ml的IFN-γ进一步按不同时间段干预。2.骨桥蛋白基因表达活性对照组细胞表达一定量的骨桥蛋白基因(与β-actin基因水平光密度比值0.831±0.081),IFN作用于血管平滑肌细胞后,骨桥蛋白基因表达活性明显增强,IFN-γ干预24h后(1.034±0.029)比值提高了24.49%,到48h后(1.064±0.015)比值已提高到28.03%,对照组与各干预组间差异均有显著性(P<0.05)。3.治疗前后两组ifn干预24h后对照组细胞表达一定量的骨桥蛋白(条带光密度扫描为85.67±33.44),IFN干预24h后(146.65±5.19)较对照组提高71.18%;48h后(150.49±12.87)较对照组提高75.66%。对照组与各干预组间差异均有显著性(P<0.05)。骨桥蛋白与动脉配方硬化的关系骨桥蛋白是一种相对分子量约为44kDa的分泌型糖基化磷蛋白,约含300个氨基酸残基,其氨基酸序列分析表明其含特异的RGD(Arg-Gly-Asp)基元——细胞黏附功能阈,该基元是骨桥蛋白分子发挥黏附功能的结构基础,具有高度保守性,如果变异或缺失,将丧失其促黏附的功能。骨桥蛋白能诱导培养的主动脉内皮和平滑肌细胞黏附并呈剂量依赖性,同时能促进血管平滑肌细胞在Boyden-typechamber中的迁移,说明骨桥蛋白是一种血管细胞重要的黏附和趋化因子。有资料显示,平滑肌细胞自身能分泌骨桥蛋白,由于骨桥蛋白本身与骨基质钙化和重吸收密切相关,而且有研究表明其在动脉粥样硬化斑块坏死区和钙化区mRNA及蛋白表达亦增加,同时骨桥蛋白还与钙质沉积紧密相关。这就进一步证实动脉粥样硬化发生发展的过程与骨桥蛋白的功能密切相关。骨桥蛋白不仅是动脉内膜增生而且也是参与此项过程(动脉损害的增生与迁移)的营养不良性钙化的中介因子。综上所述,骨桥蛋白能促进平滑肌细胞增殖、分化、黏附和营养不良性钙化,而这些病变是动脉粥样硬化、再狭窄、高血压等病理过程的重要环节,因而骨桥蛋白与上述病理过程密切相关,研究骨桥蛋白的调节机制,将会有利于这些疾病发病机理的进一步研究。许多文献报道IFN能抑制胶原合成、平滑肌细胞增殖及内膜增生,是动脉粥样硬化的抑制剂,但近年有些报道表明IFN是一种平滑肌细胞增生的双向调节剂,其抑制及促进平滑肌细胞增生的作用依赖于体内PDGF因子受体的上调与下调,而平滑肌细胞增生与动脉粥样硬化及血管再狭窄等病理过程密切相关,因此可推断IFN在动脉粥样硬化及血管再狭窄过程中也起着双向调节作用。其抑制作用已被许多研究所证实,但促进作用机制还不清楚。也许与IFN能诱导干扰素可诱导蛋白-10(IP-10)的形成有关,许多研究表明IP-10是平滑肌细胞增生、迁移、炎症反应强有力的促进剂;此外,有研究表明IFN-γ在动脉粥样硬化斑块处表达增加;IFN-γ还可诱导1-α羟化酶基因表达增加,1-α羟化酶能使25羟VitD转变为1,25-(OH)2VitD,后者是VitD的活性产物,能显著促进钙化形成。而平滑肌细胞迁移、增生、钙化与动脉粥样硬化和血管损伤后再狭窄、高血压等病理过程密切相关。因此,IFN-γ是这些病理过程的重要调节因子。其对这些病理过程的作用是通过复杂的基因调控网络来完成的。本研究发现IFN-γ能刺激血管平滑肌细胞表达骨桥蛋白增多,RT-PCR结果显示基因表达