胰岛素样生长因子对大鼠胸主动脉平滑肌细胞骨桥蛋白表达的影响

胰岛素样生长因子对大鼠胸主动脉平滑肌细胞骨桥蛋白表达的影响

血管平滑肌细胞的过度增殖、增生和分化是动脉硬化和血管再狭窄的重要步骤。平滑肌细胞的形态特征与形态密切相关。根据结构和功能的不同,血管平滑肌细胞分为收缩与合成两种类型。由收缩表型向合成表型转化是VSMC增殖的必要条件。近年来,人们用差异显示的分子生物学技术对培养的VSMC表型转化的基因标志的研究发现,骨桥蛋白(osteopontin,OPN)在VSMC由收缩转化为合成型的过程中占据了很重要的地位,是VSMC表型转化的标记基因。骨桥蛋白是细胞外基质中一种重要的功能性蛋白,因其介导骨组织细胞与骨基质的连接,参与骨基质矿化和重吸收过程而得名。近年来,骨桥蛋白作为一种机体反应蛋白,在抗炎和损伤修复过程中的重要作用逐渐引起人们的重视。骨桥蛋白基因表达具有组织细胞特异性,并且受多种激素、生长因子,肿瘤促进剂及原癌基因表达产物的调控。诸多生长因子和细胞因子也可调控骨桥蛋白基因的转录。在骨组织中,IL-1α、TNF-α、1,25-(OH)2VitD3等均能刺激破骨细胞大量合成和分泌骨桥蛋白。在心血管系统中,一系列参与动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄的活性因子,如PDGF、bFGF、TGFβ、AngⅡ等均能刺激血管内皮细胞和平滑肌细胞表达骨桥蛋白分子。但目前国内外还未见报道IGF对平滑肌细胞内骨桥蛋白基因表达的影响,本实验以培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞为实验对象,旨在研究这种细胞因子对骨桥蛋白基因表达的影响。为进一步研究动脉粥样硬化的发病机制提供线索。1材料和方法1.1引物和试剂SD大鼠由上海瑞金医院实验动物中心提供;DMEM培养基由Gibco公司提供;IGF-I购自晶美生物工程有限公司;抗骨桥蛋白IgG多克隆抗体购自SantaCruz公司;兔抗山羊的HRP购自华美公司;引物由上海申友生物技术有限公司合成,dNTP、TaqDNA聚合酶、AMV反转录酶为Promega公司产品。Ecl显色液购自博彩公司。1.2dmem的检测选用8～10wk龄♂SD大鼠,取胸主动脉,应用贴片法培养基为含体积分数为10%小牛血清的DMEM培养基,待平滑肌细胞长满培养瓶后,用2.5g·L-1胰蛋白酶消化传代,实验选用第6代细胞。1.3gl-13、4和4.当传代细胞生长至80%汇合时,加入不同浓度IGF-I(5、10、20、30μg·L-1)继续培养24h,其中IGF-I(20μg·L-1)干预的细胞按时间再分为3、24、48h干预组,按异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法分别提取细胞总RNA,以培养基内不加IGF的细胞作对照。1.4rt-pcr扩增逆转录反应体系20μl:50mmol·L-1tris-HCl(pH8.3),50mmol·L-1KCl,10mmol·L-1MgCl2,10mmol·L-1DTT,0.25mmol·L-1Spermidine,1mmol·L-1dNT-Ps,0.2μgOligo(dT)15,20URnasin,10UAMV逆转录酶,1μgRNA,混匀离心。反应条件:42℃55min,95℃5min,立即冰浴5min后短暂离心。用于骨桥蛋白基因序列扩增的引物序列为:上游:5′CAAGGAGTATAAGCAGAGGGC3′下游:5′CTCTTAGGGTCTAGGACTAGCTTGT3′,扩增片段长度200bp;β-actin引物序列为:上游:5′GGTATGGGTCAGAAGGACTCC3′;下游:5′TGATCTTCATGGTGCTAGGAGCC3′,扩增片段为843bp;RT-PCR50μl反应体系:0.5μgRNA的cDNA,2.5mmol·L-1MgCl2,10mmol·L-1tris-HCl,50mmol·L-1KCl,0.01%Gelatin,0.1%Triton-X100,0.2mmol·L-1dNTP,50pmol骨桥蛋白上下游引物或50pmolβ-actin上下游引物。反应条件:94℃,5min后,94℃变性,1min,45℃退火,45s,72℃延伸,1min,再72℃延伸10min,扩增产物于2%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)进行电泳,结束后,于紫外灯下观察扩增结果,并进行图片光密度扫描。以骨桥蛋白与β-actin电泳条带的光密度比值来作为骨桥蛋白mRNA的相对表达量。1.5抗骨桥蛋白抗体检测提取蛋白见文献,配10%分离胶与4%浓缩胶,各加20μg变性蛋白样品与5×上样缓冲液1:6混合,置于5×Tris-甘氨酸缓冲液中,冰浴中以80V电压,电泳120min,再以0.08A电流持续转膜120min,然后予10%TBST脱脂奶粉封闭液封闭,37℃振摇2h后4℃过夜,d2洗膜2次后加入1∶200抗骨桥蛋白抗体稀释液,37℃振摇2h,洗膜2次,加入1∶1000的兔抗山羊HRP抗体稀释液37℃振摇1h,滴1∶1Ecl显色液于膜上,反应5min,压片15min后将胶片置于显影液和定影液各2min后观察。1.6密度分析采用美国Kodak公司ID数码成像分析系统软件对RT-PCR及Western-blotting图片进行定量分析。1.7统计处理全部实验数据均采用x¯±sx¯±s表示,差异的显著性采用组间t检验。2结果2.1igf对血管平滑肌细胞骨桥蛋白mrna表现的影响2.1.1骨桥蛋白与-actin蛋白水平比较如Tab1所示,对照组细胞表达一定量的骨桥蛋白基因(与β-actin基因水平光密度比值0.735±0.170),5和10μg·L-1IGF组骨桥蛋白与β-actin基因水平光密度比值与对照组比较,无统计学意义。20和30μg·L-1IGF干预组光密度比值分别较对照组提高了40.44%和44.76%,且有统计学意义。20和30μg·L-1IGF干预组相比无统计学意义。因此用浓度为20μg·L-1IGF进一步按不同时间段干预。2.1.2igf干预前后骨桥蛋白与-actin基因水平的变化如Fig1,Tab2所示,IGF(20μg·L-1)作用于VSMC后,骨桥蛋白基因表达活性明显增强,IGF干预3h后,骨桥蛋白与β-actin基因水平光密度比值1.029±0.060,较对照组光密度比值提高了39.70%,24h后(1.032±0.071)比值提高了40.44%,到48h后(1.132±0.190)比值已提高到54.05%,对照组与干预组间差异均有统计学意义(P<0.05)。2.2igf干预前后3h的比较如Fig2,Tab3所示,对照组细胞表达一定量的骨桥蛋白(条带光密度扫描为77.96±15.21),IGF干预后3h(119.51±16.983)较对照组提高53.30%;24h后(167.98±15.780)较对照组提高1.15倍;48h后(175.64±9.913)较对照组提高1.25倍。对照组与干预组间差异均有统计学意义(P<0.05)。3骨桥蛋白及igf抑制剂的激活近年来,许多研究表明骨桥蛋白(osteopontin,OPN)基因在VSMC由收缩转化为合成型的过程中占据了很重要的地位,是VSMC表型转化的标记基因,骨桥蛋白在VSMC增殖过程中起着非常重要的作用。骨桥蛋白是一种相对分子量约为4.4×104的分泌型糖基化磷蛋白,约含300个氨基酸残基,其氨基酸序列分析表明其含特异的RGD(Arg-Gly-Asp)基元——细胞粘附功能阈,该基元是骨桥蛋白分子发挥粘附功能的结构基础,具有高度保守性,如果变异或缺失,将丧失其促粘附的功能。骨桥蛋白能诱导培养的主动脉内皮和平滑肌细胞粘附并呈剂量依赖性,同时能促进VSMC在Boyden-typechamber中的迁移,说明骨桥蛋白是一种血管细胞重要的粘附和趋化因子。有资料显示,平滑肌细胞自身能分泌骨桥蛋白,由于骨桥蛋白本身与骨基质钙化和重吸收密切相关,而且有研究表明其在动脉粥样硬化斑块坏死区和钙化区mRNA及蛋白表达亦增加。同时,骨桥蛋白还与钙质沉积紧密相关。因此进一步证实动脉粥样硬化发生发展的过程与骨桥蛋白的功能密切相关。骨桥蛋白不仅是动脉内膜增生而且也是参与此项过程(动脉损害的增生与迁移)的营养不良性钙化的中介因子。由此可见,骨桥蛋白能促进平滑肌细胞增殖、分化、粘附和营养不良性钙化,而这些改变是动脉粥样硬化、再狭窄、高血压等病理过程的重要环节,因而骨桥蛋白与上述病理过程密切相关,研究骨桥蛋白的调节机制,将会有利于这些疾病过程发病机制的进一步研究。我们研究结果说明,IGF能刺激血管平滑肌细胞表达骨桥蛋白增多,RT-PCR结果显示基因表达增多,而Western-blotting条带光密度扫描亦显示其表达的蛋白也增多。说明IGF能在基因水平上刺激骨桥蛋白的表达。而IGF是一种可刺激平滑肌细胞生长,迁移和影响细胞周期进程的生长因子,平滑肌细胞可自行分泌,并且在动脉粥样硬化斑块处其表达增加,循环胰岛素和IGF水平在高血压患者中也增高,因此,IGF与动脉粥样硬化,血管损伤后再狭窄和高血压等病理过程密切相关。本研究发现IGF可刺激骨桥蛋白合成,这不仅进一步证实了骨