二氢杨梅素在葡萄科的分布及应用

二氢杨梅素在葡萄科的分布及应用

1藤茶及持续绿茶观二羟基杨树林素，又称二羟杨树林素和蛇葡萄素，是二羟黄酮类化合物，存在于葡萄糖、杨梅、杜鹃、藤黄、赫拉和柳树科植物中，尤其是在葡萄科的藤茶中。二氢杨梅素广泛分布在我国云南、广西、广东、江西、湖南、贵州、湖北、福建等地的显齿蛇葡萄植物茎叶中,其含量高达37.4%~38.5%。藤茶为葡萄科蛇葡萄属中的一种野生藤本植物,学名为显齿蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata)。很久以来,我国壮族和瑶族人民将其幼嫩茎叶制成保健茶,用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、黄疸型肝炎、疮疖等病症,夏天泡茶数日不馊,有“神茶”之称。经化学成分分析,发现藤茶是一种富含黄酮类化合物的特殊植物,其中二氢杨梅素含量高达25%左右。何桂霞等的研究表明:相同季节内叶中二氢杨梅素含量比茎中的含量高3~4倍;而不同产地的藤茶中二氢杨梅素含量高低有差异,其中以江华产藤茶中含量最高,其次为张家界,株洲产含量稍低。二氢杨梅素是较为特殊的一种黄酮类化合物,除具有黄酮类化合物的一般特性外,还具有解除醇中毒、预防酒精肝、脂肪肝、抑制肝细胞恶化、降低肝癌的发病率等作用。近年来,药理实验证明藤茶总黄酮具有镇痛、止咳、广谱抗菌、降血糖、降血脂、抗氧化等多种功效,引起人们极大的关注。2醋酸乙酯溶液二氢杨梅素[(2R,3R)-3,5,7-三羟基-2-(3,4,5-三羟基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮],气特殊,白色针状结晶,mp:245~246℃,25℃水中溶解度为4%,热水中溶解度更大;易溶于甲醇、乙醇及丙酮,极微溶于醋酸乙酯;难溶于氯仿、石油醚。林淑英等对DMY稳定性和影响因素进行了考察,证实二氢杨梅素溶液易发生氧化,稳定性较差,在不超过100℃,加热时间不超过30min以及酸性和中性条件可保持其化学结构稳定,而过渡态金属离子Al3+,Fe3+,Cu2+等对二氢杨梅素的氧化起诱导催化作用。3dmy提取工艺研究传统的二氢杨梅素提取方法有热提取法(煎煮法、回流提取法)和浸泡提取法(渗透法、冷浸法),均存在费时、费溶剂、效率低、重现性差、提取率低等不足,而且所用溶剂通常有毒,易对环境和操作人员造成危害。但陈玉琼等研究表明采用乙醇为提取剂,以清除超氧阴离子自由基活性为跟踪,应用二次回归正交旋转组合设计方法优化藤茶中二氢杨梅素提取的最佳条件,提取温度控制在65℃,浸提时间94min,料液比1:35,乙醇浓度74%,提取率达25%。郑成等对干藤茶叶用乙醇浸泡进行预处理,以水为溶剂提取二氢杨梅素,考察了乙醇预处理时间、茶叶与乙醇的料液比、加热时间等因素对提取率的影响,通过单因素分析和正交试验设计,确定了最佳提取工艺条件参数为:乙醇预处理时间为15h,茶与乙醇的料液比为1:8,加热时间为30min,在此条件下二氢杨梅素的提取率为34.23%。微波萃取法则是利用微波能来提高萃取效率的一种新技术。不同物质的介电常数不同,其吸收微波能的程度不同,由此产生的热能及传递给周围环境的热能也不相同。它能对萃取体系中的不同组分进行选择性加热,具有较好的选择性,且微波萃取受溶剂亲和力的限制较小,可供选择的溶剂较多。微波加热利用分子极化或离子导电效应直接对物质进行加热,因此热效率高、升温快速均匀,大大缩短了萃取时间,提高了萃取效率。杨铃等研究表明:用正交设计法,以水为溶剂,考察了提取温度、微波辐射时间及料液比3个因素,每个因素3个水平,选择L9(3×3)正交设计表;结果表明,影响DMY提取率的因素为提取温度>微波辐射时间>料液比,在提取温度为95℃,微波辐射时间为15min,料液比为1:20时二氢杨梅素的提取率最高。采用微波萃取法大大的提高了提取效率,提取时间从直接热提法的30min减少到了15min,而且以高效液相色谱直接测定目标成分的含量,使得检测更加简便、快速。3.3反应时间和方法高效逆流色谱分离技术是运用动态液-液分配原理,利用螺旋管的方向性与高速行星式运动相结合,使两相互不混溶的溶剂在螺旋管中实现高效接触、混合、分配和传递,从而将具有不同分配比的样品组分分离出来。与其他液相色谱分离技术相比,该技术不使用固相载体作为固定相。样品在互不相溶的两相中分配,克服了固相载体带来的样品吸附、损失和污染等缺点,并能重复进样,应用价值较高。逆流法提取是指提取剂从第一级加入流向最后一级,而物料从最后一级加入流向第一级,即两相逆向流动。由于DMY在热水和冷水中的溶解度差别很大,故可选择以水为提取剂,采用逆流法对原料中的DMY进行提取。张友胜等用EclipseXDB-C18高效液相色谱柱(250.0mm×4.6mm,5μm),甲醇/水体积比36:64(用磷酸调pH至3.0)为流动相,流速为1.0ml/min;进样量20μl,柱温35℃,其研究表明:选用溶剂系统为石油醚/乙酸乙酯/甲醇/水/三氯乙酸(体积比1∶3∶2∶2∶0.05),在逆流色谱仪转速为700~800r/min,进样体积为2~50ml、流速1.5~2.5ml/min的条件下,在5h内能将80%粗提物中的二氢杨梅素和杨梅素提纯到99%以上,50g粗藤茶样品连续分离其分离得率分别为85.5%和87.6%。该方法避免了分离样品与固态载体表面发生化学反应而变性以及不可逆吸附等缺陷;残留溶剂容易在较短时间内冲净,不会对后续分离产生影响,提高了分离样品的回收率。这种方法的关键之处在于合适的溶剂系统的选择和配比。3.4复配水提物的杂质重结晶是利用固体混合物中目标组分在某种溶剂中溶解度随温度变化的明显差异,在较高温度下溶解度大,降低温度时溶解度小,从而实现分离提纯。二氢杨梅素是极性化合物,在其水提物中,不可避免地含有单宁质、蛋白质、糖类、盐类以及色素等杂质,这些杂质以结合态或游离态形式与二氢杨梅素共存,需经过多次重结晶除去杂质。二氢杨梅素在热水中的溶解量约为在冷水中的30倍,而且采用水加热重结晶提纯法具有操作简便、安全、廉价的特点。严赞开等采用双溶剂法重结晶,用38倍的无水乙醇溶解粗提物,用少量活性炭脱色,趁热过滤后蒸出大部分乙醇,将残留液倒入4倍的水中,陈化结晶,经2次重结晶,二氢杨梅素的含量从50.0%提升到90.0%以上。3.5投资及回用法大孔吸附树脂是一种不含交换基团的、具有大孔结构的高分子吸附剂,是一种亲脂性物质。通过有选择地吸附有效成分,经洗脱回收,除掉杂质的一种纯化精制的方法,工艺简单,操作方便,能耗少;操作条件温和,避免了有效成分失活,而且无毒、无污染;树脂容易回收再生,可反复利用,提取效率高。张友胜等采用“增温溶解,保温过柱,温水解吸”的方法对显齿蛇葡萄中的二氢杨梅素进行提制研究。提纯二氢杨梅素时,用单位数量的D-16大孔吸附树脂处理料液,结果表明:该方法的适宜温度为50~70℃,最好为60℃,该方法能很好地将70%左右的二氢杨梅素提纯到80%;过柱时上柱料液浓度、过柱速度以及解吸时水的流速对二氢杨梅素的提制均有影响。但该法缺点为树脂用量过大,只适合于小批量不适合工业生产。4流动相的选择薄层扫描法系指用一定波长的光照射在薄层板上,对薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光的斑点进行扫描,将扫描得到的图谱及积分值用于药品的质量检查的方法。与高效液相色谱法相比,具有多通道效应,可同时平行分离分析多个样品;流动相用量少且选择范围宽、更换方便;固定相为一次性使用,对样品的预处理要求不高等优点。何桂霞等采用薄层扫描法测定藤茶中二氢杨梅素的含量,用定量毛细管吸取供试品溶液1μl,对照品溶液2μl,分别点样于硅胶G-CMC-Na薄层板(105℃活化0.5h)上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶8∶5)为展开剂展开,展距15cm,用3%FeCl3乙醇溶液喷雾,显色后,覆盖相同大小的玻璃板,四周用透明胶纸密封。二氢杨梅素斑点呈紫色,测定藤茶中二氢杨梅素的含量为38.17%~38.54%,该法快速、简单、稳定,测定结果准确、可靠。4.2相对有效分离的藤茶-茎中二氢杨梅素,总评分率低,精密度高,有利于加快采收期的藤高效液相色谱分离技术是将流动相由高压泵打入系统,样品溶液经进样器进人流动相,被流动相载入色谱柱(固定相)内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,达到组分分离的目的。高效液相色谱分离技术具有分离速度快、效率高的优点。何桂霞等用HPLC法对不同产地不同采收期藤茶叶、茎中的二氢杨梅素进行含量测定,用Nova-PakC18色谱柱(150.0mm×4.6mm,5μm),甲醇:水:磷酸(27.0∶73.0∶0.1)为流动相,流速为1.0ml/min;紫外检测波长为290nm,进样量20μl,柱温25℃,保留时间为9.56min,线性关系良好,平均加样回收率为99.47%,RSD为1.68%,并分离得到二氢杨梅素纯品;且证实5月份藤茶中二氢杨梅素含量最高27.8%~31.2%,叶中含量高于茎中3~4倍。田森林等采用反相高效液相色谱法测定显齿蛇葡萄植株中不同部位的二氢杨梅素的含量,用Nova-PakC18不锈钢柱,检测波长为294nm,用甲醇-水(体积比24∶76)为流动相,变异系数为1.125%,平均回收率为95.03%,最低检测量为10ng。5药理作用5.1dmy具有保护肝脏组织结构的作用何桂霞等研究表明:DMY能抑制离体大鼠脑、心、肝匀浆及线粒体脂质过氧化并表现出剂量依赖关系;DMY对正常离体大鼠脏器组织过氧化脂质的生成均有极显著的抑制作用,并随剂量增加作用增强,而且对肝脏的脂质过氧化反应的抑制作用最强,这可能与肝脏具有物质代谢等多种功能的组织结构有关(如肝脏富含线粒体、内质网和高尔基复合体,分别与肝细胞进行功能活动的能量提供、蛋白质合成和糖原合成密切相关);线粒体肿胀程度与线粒体的生理和病理性反应有关,过度的肿胀则是线粒体损伤的表现。线粒体膨胀与脂质过氧化有关。脂质过氧化导致线粒体膜脂质及蛋白质组分改变,进一步改变膜的屏障功能,引起线粒体呼吸状态的改变,使线粒体悬液下降。DMY具有抑制脂质过氧化,保护线粒体结构的作用;DMY对Fe2+-Cys体系,H2O2-Fe2+体系,VitC-Fe2+体系诱导心、肝、脑线粒体MDA的生成均有抑制作用,且呈明显的量效关系。5.2氢杨梅素mic的抗菌性能DMY对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、大肠埃希军菌、产气杆菌、啤酒酵母、黏红酵母、青霉、黑曲霉、毛霉及根霉对枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、甲型溶血型链球菌、乙型溶血型链球菌、肺炎双球菌、白色链球菌等16种细菌均有一定的抑制作用;尤其对革兰阳性、革兰阴性球菌或杆菌作用明显;二氢杨梅素对金黄色葡萄球菌,沙门菌,大肠埃希杆菌,产气杆菌的最低抑菌浓度(MIC)均为0.625mg/ml,最低杀菌浓度(MBC)分别为0.625、0.625、1.25、1.25mg/ml;对枯草芽孢杆菌无杀菌作用;二氢杨梅素(含量90%)对牛奶酸败混合菌群和真菌具有明显的抑制作用,并随着年度增加而抑菌作用增强。在pH7.0时,纯度为99.5%的二氢杨梅素对金黄色葡萄球菌,大肠埃希菌和铜绿假单胞菌标准株的MIC分别为0.23,1.80,0.90mg/ml,MBC分别为0.45,1.80,1.80mg/ml;对金黄色葡萄球菌,大肠埃希菌和白假丝酵母菌临床分离株的MIC分别为0.06,1.80,0.90mg/ml;MBC分别为0.11,1.80,1.80mg/ml。从显齿蛇葡萄中分离的DMY对金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌标准株,乙型溶血性链球菌临床分离株,肺炎链球菌,流感嗜血杆菌有抑菌作用,MIC均为0.63mg/ml。5.3dmy对四氯化碳和d-半乳糖所致急性肝损伤小鼠血清相关指标的影响周天达等证实二氢杨梅素能拮抗去甲肾上腺素(NE)和高K+所致的兔胸主动脉条收缩,显示双氢杨梅树皮素对肠平滑肌和主动脉条的α受体具阻断作用;并进一步证实,二氢杨梅素对NE所引起的依赖内Ca2+释放的收缩有明显的抑制作用,对NE依赖细胞外Ca2+性收缩仅在较高浓度时才显示抑制作用,提示双氢杨梅树皮素对电压依赖性钙通道(PDC)有选择性阻滞作用,有望开发为抗高血压药。DMY能显著地抑制CCl4、D-Gla和ANIT所致急性肝损伤小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和总胆红素(T-BIL)的升高,减轻肝组织的病理损害程度,降低CCl4所致小鼠肝中MDA生成量,提高SOD活力,明显抑制血清中谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)活性升高。DMY0.05、0.10g/kg灌胃7d能明显降低四氯化碳急性肝损伤小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性;明显降D-半乳糖胺急性肝损伤小鼠血清ALT、AST活性和总胆红素(T-BIL)含量;明显降低异硫氰酸萘酯急性肝损伤小鼠血清ALT活性和T-BIL含量。DMY0.1、0.3、0.6g/kg灌胃7~8d,对四氯化碳和D-半乳糖所致急性肝损伤小鼠血清ALT和AST均有明显的降低作用,并随DMY剂量的增加而增强。含0.1%DMY饲料喂养大鼠,能明显抑制D-半乳糖胺肝损伤大鼠血清ALT、AST、乳酸脱氢酶(LDH)、α-生育酚水平和谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比值的升高;DMY对体外培养的大鼠肝细胞四氯化碳中毒性损伤、D-半乳糖胺和脂多糖诱导的小鼠肝损伤有显著的保护作用。5.5dmy的药效学作用DMY浓度为20、40、80μmol/L时,能抑制体外培养的小鼠B16黑色素瘤细胞对重组细胞基底膜的侵袭,侵袭抑制率分别为36.1%、59.6%、79.1%;同时抑制B16瘤细胞的运动能力,运动能力抑制率分别为51.6%、56.5%、66.8%;降低B16瘤细胞对层黏连蛋白、纤维黏连蛋白和重组细胞基底膜的黏附,降低瘤细胞黏附的效应与DMY浓度呈正相关。DMY150、200mg/ml含药小鼠血清对B16黑色素瘤细胞增殖有抑制作用,能阻断细胞的DNA合成和复制而产生抑癌作用。DMY100、200、250mg/kg给每只尾静脉注射2×105个B16黑色素瘤细胞的小鼠灌胃18d,能明显抑制小鼠B16黑色素瘤细胞肺转移灶,抑制率分别为31.0%、40.6%、61.2%。DMY浓度为0.8~500μmol/L时,对体外培养的小鼠B16黑色素瘤细胞的抑制达27.8%~78.9%。DMY10