高效液相色谱法同时测定祛痘类化妆品中12种禁限用物质

高效液相色谱法同时测定祛痘类化妆品中12种禁限用物质

抗癫痫药物或抗癫痫药物是目前最难控制的药物类型之一。这种非法添加抗生素的现象很常见。鉴于滥用抗菌类药物的严重后果,我国和欧美发达国家均将抗菌类药物列入化妆品禁用或限用物质名单。有关高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法测定祛痘类化妆品中抗菌类药物的方法已有文献报道[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16],检测的各类目标成分很多,已发现的非法添加成分主要有甲硝唑、氯霉素、水杨酸、氧氟沙星、环丙沙星等。通过深入研究发现,目前国内祛痘类化妆品非法添加的化学成分主要包括依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯、氯霉素、氯霉素二醇物、磺胺甲口恶唑、甲硝唑、替硝唑和水杨酸12种。其中,氯霉素、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯、磺胺甲口恶唑、甲硝唑、替硝唑等10种成分属临床常用抗菌类处方药,为禁用物质;水杨酸属消毒防腐类药物,《化妆品卫生规范》2007年版规定其为限用物质,明确除香波外不得用于三岁以下儿童使用的产品中,同时标签上必须标注“含水杨酸”,但很多添加水杨酸的祛痘类化妆品未按规定在标签上标识。如采用现有标准体系检测上述禁限用物质,至少需要5种以上色谱系统,造成监管资源的巨大浪费。本文建立了一种同时测定化妆品中上述12种化学成分的高效液相色谱方法,可满足化妆品监督检验的实际工作要求,大大提高了监管效能。1实验部分1.1药品化学品来源岛津LC20-AT型高效液相色谱仪(配二极管阵列检测器);超纯水器;电子天平。依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯、氯霉素、氯霉素二醇物、磺胺甲口恶唑、甲硝唑、替硝唑、水杨酸均来源于中国药品生物制品检定所。乙腈为色谱纯,甲醇、磷酸、三乙胺、盐酸等其他试剂均为分析纯。1.2流动相ab色谱柱:ACEC18(250mm×4.6mm,5μm);流速:1.5mL/min;柱温:40℃;进样量:20μL;检测波长:210nm(林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯)和277nm(氯霉素、氯霉素二醇物、甲硝唑、替硝唑、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲口恶唑、水杨酸);流动相:乙腈(A),0.025mol/L磷酸三乙胺溶液(B,取1.54mL磷酸至930mL水中,用三乙胺调至pH5.5,加入70mL乙腈,混匀),梯度洗脱:0～10min,100%～95%B;10～15min,95%～93%B;15～22min,93%～62%B;22～23min,62%～100%B;23～32min,保持100%B。1.3混合标准溶液的配制分别准确称取12种标准品适量,用甲醇-0.1mol/L盐酸混合溶液(体积比1∶1)配制成质量浓度约为2500mg/L的标准储备溶液。分别精密量取一定体积的氯霉素、氯霉素二醇物、甲硝唑、替硝唑、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲口恶唑、水杨酸标准储备溶液,用流动相B稀释配制成5、10、20、40、100、200mg/L的系列混合标准溶液Ⅰ。分别精密量取一定体积的林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯标准储备溶液,用流动相B稀释配制成25、50、100、200、500、1000mg/L的系列混合标准溶液Ⅱ。1.4分析用量准确称取样品约1.0g,置10mL具塞比色管中,加甲醇与0.1mol/L盐酸混合溶液(体积比1∶1)至刻度,摇匀,超声提取20min,必要时离心,取上清液经0.45μm滤膜过滤后供分析用。若样品中待测成分的浓度超出线性范围的上限,用流动相B为稀释溶剂进行适当稀释处理。1.5定性分析的方式采用与标准品色谱保留时间和紫外吸收光谱图比较的方式进行定性分析;取系列标准溶液Ⅰ和Ⅱ分别进样,以质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,进行线性回归建立标准曲线,用外标法进行定量分析。2结果与讨论2.1实验条件的优化2.1.1碱土中酸液或碱液从溶解度上分析,氯霉素、氯霉素二醇物、水杨酸微溶于水,易溶于甲醇、乙醇;硝基咪唑类微溶于水和乙醇;喹诺酮类药物微溶于水和甲醇,易溶于酸溶液或碱溶液;林可霉素类药物易溶于水或甲醇中;磺胺甲口恶唑在水中几乎不溶,在稀酸溶液中易溶。用水溶液作为提取溶剂时,氯霉素、氯霉素二醇物、磺胺类等成分的回收率较低;用纯甲醇或乙腈作为提取溶剂时,喹诺酮类成分的回收率较低;比较发现,甲醇-0.1mol/L盐酸(体积比1∶1)作为提取溶剂时,12种成分的提取效率高,回收率稳定。2.1.2紫外吸收特征从12种禁限用物质的紫外光谱图来看,氯霉素、氯霉素二醇物的紫外吸收光谱相似,最大吸收波长在271～277nm左右;依诺沙星、环丙沙星和氧氟沙星的吸收光谱相似,最大波长在265～295nm;甲硝唑和替硝唑的最大吸收波长均为319nm;磺胺甲口恶唑和水杨酸的最大吸收波长分别为266nm和296nm;林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯无紫外吸收特征,存在末端吸收。综合考虑后选取277nm作为氯霉素、氯霉素二醇物、甲硝唑、替硝唑、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲口恶唑和水杨酸的检测波长,选择210nm作为林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯的检测波长。2.1.3流动相ph值的影响12种成分中既有酸性化合物和碱性化合物,又有两性化合物,因此流动相pH值对分离效果的影响较大。考察了流动相pH值为4.0～6.0时的色谱行为,随着pH值增加,氯霉素二醇物、氧氟沙星、林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯的保留时间明显增加,依诺沙星、环丙沙星和磺胺甲口恶唑的保留时间明显减少,甲硝唑、替硝唑、水杨酸和氯霉素的保留时间变化不大。在pH5.5时,各成分的分离效果最好。2.1.4温度对林分测定总样的影响分别考察了30、35、40、45℃柱温条件下12种成分的色谱行为。实验结果表明,温度升高时,林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯的保留时间增加,其他成分的保留时间减少。在40℃时各成分的分离效果最优。2.2标准品的相对标准偏差分别吸取100mg/L和500mg/L的对照品溶液20μL,在波长277nm和210nm分别平行测定6次,氯霉素二醇物、甲硝唑、替硝唑、水杨酸、氯霉素、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲口恶唑(100mg/L)峰面积的相对标准偏差分别为0.6%、0.04%、0.1%、0.6%、0.03%、0.03%、0.5%、0.04%和0.6%,林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯(500mg/L)峰面积的相对标准偏差分别为0.2%、0.1%和0.5%。分别吸取100mg/L和500mg/L的标准品溶液20μL,于0、2、4、8、12、24h时进样,氯霉素二醇物、甲硝唑、替硝唑、水杨酸、氯霉素、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲口恶唑(100mg/L)峰面积的相对标准偏差分别为0.6%、0.1%、0.3%、1.9%、0.2%、0.2%、0.5%、0.2%和0.5%,林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯(500mg/L)的相对标准偏差分别为0.2%、0.5%和1.7%。表明样品溶液在24h内稳定。2.3克林素、克林氧化酶、克林氧化酶磷酸酯2种成分的线性关系取“1.3”配制的系列混合标准溶液,按上述方法测定,线性范围、回归方程及相关系数见表1。林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯3种成分在25～1000mg/L范围内线性关系良好,其他9种成分在5～200mg/L范围内线性关系良好,相关系数均大于0.997。在霜剂空白样品中加入一定量的对照品溶液,按S/N=3和S/N=10分别计算仪器检出限和定量下限,方法的检出限和定量下限结果见表1。2.4测定样品的测定取一批霜剂空白样品各1g,分别做高、低两个浓度水平的加标回收实验,平行配制6份,按上述方法进行测定,结果见表2。12种禁限用物质的平均回收率为88%～115%,RSD均小于5%,符合国家食品药品监督管理局发布的《化妆品及其原料中禁限用物质检测方法验证技术规范》要求。2.5非法添加化学成分在优化条件下,标准品溶液的色谱图见图1,12种成分的色谱峰分离度均大于2.2,理论塔板数均大于6650。按上述方法,从商场收集133批化妆品,检出成分为甲硝唑、氯霉素、氯霉素二醇物、磺胺甲口恶唑、林可霉素、氧氟沙星、依诺沙星、替硝唑,合格率为91.7%;从网络收集228批化妆品,12种成分均有检出,合格率仅为58.7%。在检出的12种非法添加化学成分中,依诺沙星、克林霉素磷酸酯、氯霉素二醇物、替硝唑等为国内首次报道。在不合格样品中,最常见剂型为膏霜剂,检出频率最高的成分为林可霉素、氧氟沙星和甲硝唑;混合添加占非法添加样品的65.1%,最常见添加方式为“硝基咪唑类+林可霉素类+喹诺酮类”。同时混合添加各种药物引发的不良反应值得关注。研究还发现大部分含有氯霉素的化妆品均同时检出含量较高的氯霉素二醇物,甚至发现只含氯霉素二醇物不含氯霉素的情况。氯霉素二醇物是合成氯霉素的主要中间体或手