不同ph混合福尔马林固定液固定小鼠皮肤免疫组化染色

不同ph混合福尔马林固定液固定小鼠皮肤免疫组化染色

抗原是指刺激身体产生阻力，并与抗体结合的材料。它的抗原性主要由抗原剂决定。机体组织中的抗原,经甲醛固定、石蜡包埋后,部分或全部抗原决定簇被封闭,影响免疫组化的标记效果。选择最佳抗原修复技术暴露被封闭的抗原决定簇,是免疫组化技术中的关键步骤,固定液的pH值对免疫组化的染色强度和背景染色直接影响也要考虑。本研究选用caspase-3等5种在皮肤切创愈合过程中呈规律性表达的抗体,应用不同抗原修复技术对不同pH值混合福尔马林固定液固定的小鼠皮肤切创后3d标本进行免疫组化染色,比较不同抗原修复方法及固定液pH值对皮肤组织石蜡切片的免疫组化染色效果的影响。1材料和方法1.1u3000po4和nah2po4对土壤ph值的影响健康雄性成年清洁级昆明系小鼠15只,每只重35～40g(中国医科大学实验动物中心提供)。造小鼠背部皮肤长1cm的纵行全层切口,于伤后第3d取创口处组织(1.5cm×1cm),分别固定于pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的混合福尔马林固定液(Na2HPO4和NaH2PO4依不同比例配制而成,用1mol/L的HCl和NaOH校正pH值)中12h,脱水、浸蜡、包埋、切片(厚度5μm)后,裱片于经左旋多聚赖氨酸处理的清洁载片上,放置于60℃温箱烤片1h。1.2耐药因素的sabc染色选择pH7.0的混合福尔马林固定液固定的皮肤组织切片,用高压热修复、微波修复、胰蛋白酶消化、胃蛋白酶消化和微波+胰蛋白酶消化对抗原修复后进行SABC染色;然后选染色效果最佳的抗原修复方法,对不同pH混合福尔马林固定液固定的皮肤组织切片进行抗原修复后进行SABC染色。1.2.1微波+胃蛋白酶联合免疫治疗法常规石蜡切片脱蜡水化后进行抗原修复:(1)高压热修复。将压力锅(苏泊尔)中0.01mol/L枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)加热至沸腾;切片竖立于沸腾的缓冲液中,盖锅压阀,自喷气计时2min断离热源,切片室温自然冷却。(2)微波修复。切片放入盛有0.01mmol柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)容器中,置容器于微波炉(格兰仕微波炉,WP750型,750W)内加热至轻度沸腾,关闭微波炉;5min后再次加热至轻度沸腾后关闭,5min后取出容器,室温自然冷却。(3)胰蛋白酶消化修复。0.1%胰蛋白酶37℃消化15min。(4)胃蛋白酶消化修复。0.4%胃蛋白酶37℃消化15min。胰蛋白酶、胃蛋白酶及切片使用前均预热至37℃。(5)微波+胰蛋白酶修复。同上微波法修复切片加热至一次沸腾后关闭,5min后取出容器,自然冷却至37℃,胰蛋白酶温箱消化8min。每种修复方法取6张切片(1张为阴性对照),另设一组不进行抗原修复的对照片。所有切片自然冷却后,PBS冲洗3次,每次3min。1.2.2caspase-6、caspase-7多克隆抗体检测兔抗caspase-3、IL-8、IL-10多克隆抗体(购自武汉博士德生物工程有限公司)和羊抗caspase-6、caspase-7多克隆抗体(购自SantaCruzBiotechnologyInc)作为一抗,按SABC免疫组化试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)说明染色,DAB显色。以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。1.2.3阳性细胞率400倍显微镜下,随机选择每张切片损伤周边区内10个视野,计数单核细胞、中性粒细胞及成纤维细胞的阳性细胞数(胞浆有明显的棕黄色)与此3种细胞总数的比值,取平均值作为阳性细胞率。阳性细胞<5%为(-);5%～10%为(+);10%～25%为(++);25%～50%为(+++);50%～75%为(++++);>75%为(+++++)。2微波+胰蛋白酶法应用pH7.0的混合福尔马林固定液固定的皮肤组织切片,采用5种不同抗原修复方法进行抗原修复后,其免疫组化染色结果见表1。由表1可见,应用微波+胰蛋白酶法进行抗原修复,阳性细胞率最高,且不发生脱片现象(照片1)。热修复法阳性细胞率高于蛋白酶修复法;高压锅法阳性细胞率略高于微波法,但脱片率明显高于后者;胃蛋白酶修复脱片数高于胰蛋白酶组。未修复组阳性细胞染色率极低,阴性对照组均不显色。对不同pH值固定液固定的皮肤组织石蜡切片,用微波+胰蛋白酶双修复法进行抗原修复后的染色结果见表2。当固定液的pH为7.0和8.0时,染色效果最佳(照片2)。3热抗原修复法抗原修复是石蜡、冰冻切片免疫组织化学染色前使用酶、表面活性剂、微波金属盐等,使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或修复,抗原性得到一定程度的恢复的过程。抗原修复能最大程度地恢复在制片等过程中损失的抗原性,使原来认为不能在石蜡切片上进行免疫组化染色的许多抗体获得了良好的染色结果,成为一种有效的补救措施。抗原修复方法主要包括热修复和酶消化法。高压锅、微波等热修复法,就是通过产生的高温高压将组织中因甲醛处理而形成的醛链打开,使抗原暴露。本研究结果显示,高压锅法阳性细胞率略高于微波法。这可能是因为高压锅进行封闭的高压高温处理,处理强度较微波大得多,使更多的抗原得以暴露。高压锅修复抗原造成皮肤标本形态扭曲,出现较微波抗原修复严重的脱片现象,可能温度过高(可达120℃)是其原因之一。热抗原修复法的最适温度在92～98℃,恒定95℃效果最好。微波抗原修复可通过实验过程中隔窗观察修复液轻度沸腾,关闭微波炉,持续5min后重复操作1次,温度接近热抗原修复法的最适温度92～98℃,使较小的皮肤切片能够保持相对完整,脱片率明显低于高压修复。但微波焦点范围狭小,照射不均匀,且需要2次照射,使个别切片背景染色较深。蛋白酶消化修复抗原,因酶消化能力强,容易引起脱片,甚至破坏抗原性和组织结构,使用时应注意消化时间,而且消化后应用PBS液充分洗涤。本实验中按照蛋白酶消化试剂盒要求操作,发现在其标准时间内蛋白酶消化染色效果不如热修复法,如增加修复时间则脱片数相应增加。胃蛋白酶修复效果略强于胰蛋白酶,但胃蛋白酶组脱片现象明显高于胰蛋白酶组,这可能与胃蛋白酶偏酸性,作用强,可增加细胞与组织通透性使抗原抗体更好的结合,同时也容易造成组织结构破坏有关。本实验尝试使用微波+胰蛋白酶双修复方法,通过高温将组织中因甲醛处理而形成的醛链打开,暴露抗原,同时利用酶消化溶解被覆于抗原表面的变性蛋白,由于加热时间和酶消化时间均相应缩短,较好的保持切片的完整性,未发生脱片现象,同时由于缩短了微波照射次数和时间,大大降低了背景染色,获得了良好的染色效果。常规情况下,采用10%福尔马林液固定的病理标本,使组织中蛋白质分子交联增加,抗原被封闭,影响免疫组化染色结果。本实验结果显示,中性或微碱性缓冲福尔马林固定液固定的皮肤组织免疫组化染色阳性细胞率最高,效果最佳。这可能是由于在酸性固定液中,组织中血红蛋白与其它产物相互作用可形成福尔马林色素,在免疫组化染色中易被误认为阳性物质,同时固定液可发生重聚作用,pH值低时聚合加快,使固定效果急骤下降;而在pH>8.0的碱性固定液中,抗原物质破坏,造成免疫组化染