人参皂苷rg1促进2型糖尿病大鼠肝脏组织pi3k磷酸化的研究

人参皂苷rg1促进2型糖尿病大鼠肝脏组织pi3k磷酸化的研究

糖尿病是一种严重的非小体疾病，严重危害着人类健康。2003年全球糖尿病患者数量约1.3亿人,其中90%以上为Ⅱ型糖尿病,而且每年以1%的速度递增,目前我国已有4000万糖尿病患者,占全球总数的l/5,已成为继心脑血管疾病及肿瘤之后,严重威胁人类健康的第3大疾病。胰岛素抵抗不仅是Ⅱ型糖尿病发病的重要原因和病理基础,同时与Ⅱ型糖尿病的许多并发症及代谢紊乱综合征密切相关。1材料和方法1.1动物1.1.1调查生活环境雄性60只,体重:220g左右,中科院上海斯莱克实验动物有限责任公司,批号:scxk(沪)2003-0003随机分成6组,每组10只,笼养一周,以适应环境。第二周开始,除正常组外,每组用高脂饲料(该饲料中含有59%的脂肪,20%的碳水化合物,21%的蛋白质),喂养,自由取食,每只每天18g,喂养二周后,开始给药,对照组予罗格列酮每天6mg/kg,灌胃,Rg1、Rb1、Re各组每天50mg/kg,灌胃,连续灌服2周,给药期间,各组仍予高脂饲料喂养,自由取食,每天称量体重。1.1.2提交材料大鼠取肝脏组织、下肢肌肉组织、皮下脂肪各一块,以液氮冷冻后,存储予低温冰箱(-70℃)备用。1.2聚丁酯glut4人参皂苷Re,060312,1100mg,人参皂苷Rb1,060721,1100mg,人参皂苷Rg1,070309,1100mg均为90%的纯度(吉林大学有机教研室提供),马来酸罗格列酮,规格,4mg/片07030088(葛兰素史克公司),葡萄糖转运蛋白4(Glut4)一抗,磷酯酰肌醇3激酶(PI3K),(CellSignalingTechnology提供),羊抗大鼠二抗、羊抗兔二抗(ICL实验室提供)蛋白酶抑制剂(北京鼎国生物技术有限公司)。1.3方法1.3.1蛋白酶抑制剂的制备称取100mg组织置于10mL试管中,按正常组、高脂组、对照组、Rb1组、Re组、Rg1组分别做好标记,加入1mL裂解液,于冰上匀浆。将组织匀浆液迅速移入加40uL蛋白酶抑制剂的试管,混匀后,4℃,12000r/min,离心15min。取上清至另一1.5mL试管中,-70℃保存2天,解冻,同上离心10min,取上清,将样本配制成蛋白量含量为50ug/16uL,-70℃的冰箱内贮藏备用。1.3.2tps的配伍规则采用SDS胶,10%下层胶10mL(水、30%丙烯酰胺、1.5MTRIS(PH8.8)、10%SDS、10%过硫酸铵、TEMED)4%上层胶4mL(水、30%丙烯酰胺、1MTRIS(PH6.8)、10%SDS、10%过硫酸铵、TEMED)按实验室操作手册比例配伍。1.3.3上样本的制备将混合样本在100℃的水浴中变性5min,再在冰上冷冻5min,然后放入离心机离心2min,即得上样样本。待凝胶固定后,将凝胶放入电泳槽,小心拔出梳子,上样,在100V恒定电压下跑电泳约2.5h。1.3.4膜的变化待电泳结束,将胶取下,放在转膜夹上,贴上膜,将做了标记的一面紧贴胶。将转膜夹放入转膜槽中转膜,恒定电流300mA,1h。1.3.5封闭1.3.6洗好膜,稀释二抗2:500将封闭好的膜放在稀释好的一抗(1:1000)中,4℃过夜。洗膜3次,5min,5min,15min。将洗好的膜放在稀释好的二抗(1:500)中常温,1h。洗膜3次,5min,5min,15min。1.3.7压块投影定影将洗好的膜在ECL液中完全浸透1min,放入暗盒,压片10min后,显影5min出条带后,用清水漂洗在定影液中。1.4统计方法用SPSS11.5做统计学统计,各组间采用方差分析,用表达。2结果2.1大鼠体重和体重增加的检测见表1、图1。从表1和图1可见,Re组、Rg1组和对照组的体重增加较正常组、高脂组有增高趋势,Rb1组的体重增加较少,接近于与正常组的体重,表明人参皂苷Rb能减轻大鼠体重的增加,而Rg、Re和罗格列酮不抑制大鼠体重的增加。2.2glut4引起胰岛素抵抗的可能机制见表2、图2~4。从表2和图2上可以看出Rg1组的蛋白表达要比Rb1组、Re组、高脂组、对照组和正常组有显著性差异,P<0.05,Rb1组、Re组与对照组的蛋白表达相近,但高于高脂组,接近正常组的蛋白表达。说明人参皂苷Rg1在肝脏组织中能促进PI3K的磷酸化,在肝脏组织中人参皂苷Rg1的抗胰岛素抵抗作用要优于Rb1组、Re组和对照组;而Rb1组、Re组和对照组在肝脏组织中仅有促进PI3K磷酸化的趋势,高于高脂组,说明人参皂苷在肝脏组织中有显著的促进PI3K磷酸化的作用。从表2和图3、图4上可以看出在肌肉组织中Rb1组的蛋白表达和Re组、Rg1组、高脂组、对照组和正常组有显著性差异P<0.05,Re、Rg组、对照组高于高脂组的蛋白表达,接近于正常组的蛋白表达,提示人参皂苷在肌肉组织中能促进GLUT4的表达,促进外周组织对葡萄糖的利用度,且Rb1、Rg1的这种作用明显优于罗格列酮对照组P<0.05。在脂肪组织中Rb1组的蛋白表达和Re组、Rg1组、高脂组和对照组有显著性差异P<0.05,接近于正常组的蛋白表达,Rg1组和Re组相近,对照组的蛋白和其他各组有显著性差异。提示人参皂苷可显著提高胰岛素受体(SRI)的信号通路,促进胰岛素受体的磷酸化,同时,可有效促进PI3K信号转导下游的葡萄糖摄取和转运,虽然在脂肪组织中表现出趋势,但在肌肉组织中表现出明显的促进作用,且这种作用较罗格列酮明显增加。胰岛素抵抗(insulinresistance,IR)是指胰岛素维持正常血糖的能力下降,其产生的生物学效应低于正常水平,或组织对胰岛素的反应性下降。大量研究已证明胰岛素抵抗是Ⅱ型糖尿病的主要病理生理特征,而细胞膜上葡萄糖转运蛋白体4(GLUT4)含量降低是发生IR的重要原因之一。GLUT4引起胰岛素抵抗的可能机制有:(1)GLUT4的表达量减少,Tozzo等研究发现2型糖尿病患者中,脂肪细胞所表现出的胰岛素抵抗状态与GLUT表达量减少密切相关。(2)GLUT4内在活性降低,研究表明存在胰岛素刺激时,GLUT4去磷酸化改变自身构象,把葡萄糖转运到细胞内;而胞浆内钙离子浓度的升高则可使GLUT4发生磷酸化反应,抑制其转运葡萄糖的活性。(3)GLUT4的基因表达受到抑制,MichaelGaster等在对Ⅱ型糖尿患者和正常人骨骼肌进行对比研究时得出结论:慢肌纤维比例的减少,及慢肌纤维中GLUT4表达的减少是骨骼肌产生胰岛素抵抗的原因之一。(4)GLUT4易位障碍,Seung等试验表明mtDNA衰竭引起的IR是因为减少了IRS-1的表达,从而导致GLUT4易位到质膜的障碍。鉴于GLUT4引起胰岛素抵抗的众多可能机制,本研究选取GLUT4为首选目的蛋白,但由于GLUT4仅存在于胰岛素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪细胞中,本次实验只将肌肉组织和脂肪组织采用GLUT4做为目的蛋白,而在另一个胰岛素抵抗敏感组织——肝脏组织,则采用磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)做为目的蛋白,因为PI3K是许多生命活动中关键的信号分子,PI3K介导的信号转导通路调节细胞的分裂、分化、凋亡等活动。IRS的磷酸化为下游的信号转导蛋白提供了一个高亲和力结合位点,通过与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的P85亚基结合并招募其催化亚基P110而激活PI3K,继而激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt或蛋白激酶B(PKB),最终导致GLUT4转位到细胞膜上,摄取葡萄糖。人参作为一味补虚良药,具有补脾益肺、生津,自古就被用于“消渴”病的治疗,早在《别录》中就提到其可以“止消渴”,至今人参仍然是中医临床治疗糖尿病(尤其是2型糖尿病)的常用药。近年来随着中药药理学研究的不断深入,有关人参及其提取物对血糖水平的调节逐渐得到认识。如部分研究认为人参的提取物对四氧嘧啶等造成的糖尿病动物模型具有调节血糖的作用,而另一部分研究证实人参的有效成分人参皂苷对糖尿病患者的免疫功能具有调节作用。而其中的人参皂苷Rb1,Rg1和Re,都是被认为具有调节血糖作用。有研究表明,啮齿类动物及人类在胰岛素抵抗状态下,GLUT4的表达显示明显的组织特异性调节,即在脂肪细胞中表达下降,但在骨骼肌中则被保护。罗格列酮具有良好的胰岛素增敏作用,能增加肌组织UCP-3、肝脏UCP-2的基因表达,表明它增敏的作用可能与肌组织UCP-3表达增强有关。罗格列酮治疗后虽可引起体重增加,但这种增加不以内脏脂肪增加为主,可能和皮下脂肪增加有关。与我们的研究结果相符,人参皂苷Rg1组和正常组、高脂组、对照组、Re组、Rb1组有显著性差异,Rb1组、Re组也较高脂组有显著性差异,能促使PI3K在肝脏中的磷酸化,在肌肉组织中对照组、Rb1组、Rg1组、Re组与高脂组都有显著性差异,而与正常组无显著性差异,提示人参皂苷在肌肉组织中能促进葡萄糖的转运,在脂肪组织中,GLUT4在脂肪细胞中的表达下降,高脂组与Rb1组、Rg1组、Re1组相近