rp-hplc法测定猫豆中的左旋多巴

rp-hplc法测定猫豆中的左旋多巴

猫豆是科豆科植物的李家豆。它主要分布在亚热带和亚热带，其主要有效成分是左旋多巴。左旋多巴是一种非蛋白质氨基酸,在临床上可用于治疗帕金森氏病、肝昏迷、骨折、神经痛等。文献报道了不同产地猫豆中左旋多巴的含量比较,然而对猫豆植株各部位左旋多巴的准确分布、左旋多巴在种子中的动态含量变化等并未见报道。经笔者调查发现广西东兰当地存在两个栽培种:白花猫豆和紫花猫豆。白花和紫花猫豆在当地呈混杂生长状态,其主要性状差别在于花的颜色,从种子上难以区分。因此,分别在广西东兰和广东广州建立种植基地,观察其种子、豆荚、花、叶、茎中左旋多巴动态含量变化,确定左旋多巴含量高的猫豆栽培种进行栽培推广。1测定仪器及方法Waters1525高效液相色谱仪;Waters717自动进样器;Waters2487双波长紫外检测器;Breeze色谱工作站;SB25-12DTD超声波清洗仪(功率600w,频率40HZ)MettlerToledoAL204电子天平,Milli-QBiocel超纯水机。左旋多巴对照品(广西东兰河丰药厂提供),经测定纯度大于99.5%,甲醇为色谱纯,液相用水为超纯水,提取用水为双蒸水,乙醇、醋酸、磷酸、磷酸二氢钾为分析纯。猫豆采自广西东兰县种植基地和广州白云区种植基地,经中山大学药学院生药与天然药化实验室杨得坡教授鉴定为Mucunapruriens(Linn.)DC.var.utilisBurck。2方法和结果2.1色谱条件分析色谱柱:VarianPolarisRP-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);甲醇:0.01mol/L磷酸二氢钾-磷酸缓冲液(10∶90,pH3.38)用于分析种子、花、叶、茎(色谱条件1),甲醇:0.01mol/L磷酸二氢钾-磷酸缓冲液(5∶95,pH3.17)用于分析豆荚(色谱条件2);进样量:20μL,流速:1mL/min,柱温25℃,检测波长280nm。在上述条件下,供试品溶液中左旋多巴色谱峰分离良好。色谱条件1下左旋多巴保留时间为3.96min,色谱条件2下左旋多巴保留时间为4.50min,理论塔板数以左旋多巴峰计不低于2500,色谱图见图1。2.2对照溶液的制备取左旋多巴对照品50mg精密称定,加流动相溶解并定容至50mL量瓶中,摇匀,得1mg/mL左旋多巴对照品储备液。2.3超声处理条件精密称取0.1g猫豆粉末(80目)置于15mL离心管中,加入0.1mol/L醋酸:95%乙醇(10∶1(v/v))10mL,超声处理20min,4000r/min,5min,上清液经0.2μm微孔滤膜滤过,按上述色谱条件进样分析。2.4标准曲线的绘制精密吸取左旋多巴储备液5,2,1mL,分别置于10mL量瓶,用流动相稀释至刻度,摇匀,得到0.5,0.2,0.1mg/mL的工作溶液;精密吸取左旋多巴储备液2.5,1,0.5置于50mL量瓶,稀释至刻度,摇匀,得0.05,0.02,0.01mg/mL工作溶液;从0.5,0.2,0.1mg/mL标准溶液中精密吸取0.5mL置于50mL量瓶,稀释至刻度,摇匀,得0.005,0.002,0.001mg/mL的工作溶液。10种浓度的左旋多巴对照品溶液分别按色谱条件1和色谱条件2进样20μL,测定峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标,左旋多巴的浓度为横坐标(X),绘制标准曲线,得色谱条件1回归方程:Y=1.567×107-1.252×104(r=0.9999),线性范围为0.001～1mg/mL;色谱条件2回归方程:Y=1.512×107+2.667×104(r=0.9999),线性范围为0.001～1mg/mL。2.5峰面积、峰面积及峰层内风分布取同一对照品溶液(0.05mg/mL)按上述色谱条件,重复进样6次,测得色谱条件1下峰面积分别为810550,812281,809469,812400,818295,816851,平均峰面积为813308,RSD=0.4%;色谱条件2下峰面积为826021,832168,838918,832452,830557,842498,平均峰面积为833769,RSD=0.7%。2.6左旋多巴含量测定结果取同一批猫豆和猫豆荚样品6份,精密称定,按供试品溶液的制备方法操作,分别在色谱1和色谱2条件下分析测定,测得色谱条件1下猫豆种子中左旋多巴含量分别为5.95%,6.09%,5.78%,5.71%,5.61%,5.80%,平均含量为5.82%,RSD=2.9%;色谱条件2下猫豆荚中左旋多巴含量分别为0.37%,0.38%,0.37%,0.35%,0.35%,0.35%,平均含量为0.36%,RSD=3.5%。2.7峰面积、峰面积取同一供试品溶液分别于0、1、2、4、6、8、10、12h在上述色谱条件下进样分析,测得色谱条件1下峰面积分别为9101227,9112095,9006053,9018693,9239840,9028199,8915797,9223318,平均峰面积为9080653,RSD=1.2%;色谱条件2下峰面积为445372,413690,425702,438483,437980,467462,463741,424432,平均峰面积为439608,RSD=4.3%。2.8样品的回收率取已知含量的猫豆和猫豆荚样品6份,每份约0.05g,精密称定,置于15mL离心管中,再用移液管分别精确移入用提取溶剂配置的0.285mg/mL、0.02mg/mL对照品溶液10mL,按供试品溶液制备的方法提取,分别按上述色谱条件进样分析,测得猫豆样品平均回收率为100.28%,RSD=1.5%,猫豆荚样品平均回收率为98.7%,RSD=4.47%,结果见表1。2.9样品测定2.9.1种植基地采样2.9.2项测定项样品为广西东兰基地正常采收期样品(花为盛花期样品);其余测定项为广州白云区种植基地样品,按2.9.3项、2.9.4项测定采样方法:按对角线法在种植基地选择适当植株花蕾期的花序挂牌,从荚果长至一定大小开始至猫豆荚果完全成熟干燥,每15天采样一次,编号为采样时间;其他测定项则在相应时期采样。采样后置烘箱中40℃干燥。2.9.2供试品溶液的制备精密称取猫豆种子、茎、叶、花、豆荚、根粉末(80目)各0.1g,分别按供试品溶液的制备方法处理,按照相应的色谱条件进样分析测定,结果见表2。2.9.3白色和紫花猫豆种子左旋转巴士的动态监控精密称取种子粉末(80目)0.1g,按供试品溶液制备方法制样,按相应色谱条件进样分析,计算含量,结果见图2。2.9.4白色和紫花猫左旋转多余健康监测精密称取豆荚粉末(80目)0.1g,按供试品溶液制备方法,按相应色谱条件进样分析,计算含量,结果见图3。2.9.5白花和紫花猫左旋转多巴的测定分别在花蕾期、盛花期、终花期采样,其余步骤同2.9.3项,结果见表3。2.9.6白花和紫猫左旋转巴士的测定分别采收嫩叶、正常叶、老叶,其余步骤同2.9.3项,结果见表4。2.9.7白花和紫猫左旋转多巴的测定分别采收幼茎和正常茎样品,其余步骤同2.9.3项,结果表5。3猫豆不同采收期的种子左旋多巴含量3.1本试验参考文献的提取溶剂组成,并以提取溶剂组成(0.1mol/L醋酸:95%乙醇)5∶1、10∶1(v/v)及不加乙醇;超声提取时间10、20、30min;猫豆粉末粒度40、60、80目,提取次数1次、2次、3次为考察条件进行正交实验,结果表明用0.1mol/LHAc:95%乙醇为10∶1(v/v)10mL,猫豆粉末80目,提取时间为20min,提取1次即可提取完全。3.2文献报道了用HPLC法测定黎豆属植物MucunamacrocarpaWall和stizolobiumcapitatum种子中左旋多巴含量。有学者对黎豆属植物stizolobiumcochinchinesis种子、荚果、藤蔓、叶片进行分析,对藤蔓、叶片中微量左旋多巴并没有定量和检出。然而国外有研究,通过液质联用分析发现猫豆叶中含有左旋多巴。本试验利用高效液相色谱法,在色谱条件1下使得种子、茎、叶、花,根基本上可达到基线分离,而在色谱条件2下豆荚也基本达到基线分离。同一色谱条件,豆荚可达到基线分离,则花和叶却得不到良好分离。因此,本试验最终采用上述两个色谱条件分别对猫豆不同部位左旋多巴进行定量分析。3.3从表2中可以发现:采收期的猫豆植株中,种子、豆荚、根、茎、叶、花中均含有左旋多巴。其中以种子中含量最高,平均达6.26%,其次是花为0.904%,叶含量最低,含量仅为0.01%。猫豆植株中以种子生物量远高于其他部位,因此选择种子作为药用部位最为适宜。3.4从不同采收期的种子中左旋多巴含量测定发现:其最高含量为5.62%(白花)/5.43%(紫花),采收自荚果开始成熟,荚果开始干枯之时。因此可确定此时为猫豆采收的最佳时期。过早,猫豆生物量未达最大;过晚,则猫豆中左旋多巴含量会减少。白花猫豆中左旋多巴含量比紫花猫豆高,可作为优选的栽培种推广。从表3、表5和图3可以发现:猫豆荚、茎、叶在幼嫩时期左旋多巴含量较高,然而组织在生长、衰老过程中左旋多巴含量快速下降。花中左旋多巴则在花蕾生长至盛花期间快速积累,在花衰老过程中逐渐减少。3.5猫豆中文又名黎豆、狗爪豆,文献中对猫豆的学名叫法也很多,通过《中国植物志》和植物分类学会(ISB)数据库发现,stizolobiumcochinchinesis和stizolobiumcapitatum(sweet)O.Kuntze实际为猫豆(Mucunapruriens(Linn.)DC.var.utilisBurck)的异名。而MucunamacrocarpaWall则为黎豆属植物大果油麻藤种子。目前我国临床用左旋多巴主要依靠进口,近年来国内开始从猫豆中提取左旋多巴。然而根据蒋伟哲等的研