中药复方化学与创新药物研究

中药复方化学与创新药物研究

中药复方是中医治疗最重要的临床应用形式，是中医辩证法理论的具体体现。它是根据“君主制”的原则选择合适的药物、味道和剂量。近年来,国内外对中药复方从不同角度探索研究,但主要集中在药理、药效方面,而有关中药复方药效物质基础的研究,即中药复方的化学研究则比较少。勿庸质疑,复方中的化学成分是中药发挥药效作用的物质基础。进行复方的化学研究,在阐明中医的方药理论,揭示中药的配伍规律和作用机制,优化制剂工艺,制定质量控制标准,实现中药现代化并走向国际市场等方面均具有重要意义。加强中药复方化学研究,进而开发研制创新药物,是重要而紧迫的任务。一、中药复方质量控制方法中药复方化学研究的目的在于阐明其有效物质基础,即以现代化学和药理学为基础,阐明中药复方有效部位和有效成分,建立有效部位和有效成分的质量控制方法及标准。为研究中药复方有效部位和有效成分的药理活性、作用机理,乃至有效成分的构效关系奠定基础;为揭示中药复方配伍规律,优化处方组成,改进制剂工艺,提高质控标准提供依据;最终实现开发研制创新药物,促进和实现中药现代化的目的。二、复方全药生物活性研究中药复方化学研究,目前多集中于以复方中某个或某些药味的有效成分或指标性成分为指标的定性与定量分析研究,而将中药复方作为一个整体,以药效为指标,对全方进行系统分离,探讨复方产生某种药理活性的物质基础的报道还不多。1.复方中各药的相互作用以复方中某个或某些药味的有效成分或指标性成分为指标的定性与定量分析研究方法,系首先根据组成复方各单味药的已有研究工作基础和研究文献,确定单味药的主要有效成分或指标性成分作为定性定量分析指标,应用各种分离与分析技术,采用拆方分析方法,探讨药物配伍(药味、药量)、制备方式(单煎、分煎和合煎)、制备条件、分离纯化方法、剂型等对主要有效成分或指标性成分质和量的影响。此类研究较多,也取得了一些有意义的结果。下面是一些古方的研究实例:四物汤:测定了各药单煎、分煎和合煎液中阿魏酸含量。表明合煎时,各成分间具有增溶效应。小青龙汤;测定了各药单煎、分煎及合煎液中麻黄碱的含量。结果显示合煎液中麻黄碱含量最低,此系甘草酸与麻黄碱作用产生沉淀所致,但合煎液与分煎液的药效并无显著差异,说明虽然甘草酸与麻黄碱形成沉淀,但口服后在体内仍具药效,因此对中药复方煎煮过程中产生的沉淀应慎重考虑其取舍。泻心汤类方:复方中同时含有大黄或甘草时,煎液中小檗碱的强烈苦味消失,不含大黄或甘草的煎液仍有强烈的苦味,原因是小檗碱与大黄鞣质、甘草酸结合,生成了难溶性沉淀物。甘草酸与小檗碱产生沉淀会导致黄连抑菌活性的降低以至丧失。四逆汤:对附子与甘草、附子与干姜及三味药配伍前后主要有效成分进行了定性与定量分析。结果表明附子与干姜配伍时,乌头碱等生物碱含量升高;而附子与甘草配伍时,乌头碱等生物碱含量降低。生脉散:合煎液中人参总皂苷的含量低于分煎液,但人参皂苷Rg3和Rh1等的含量明显高于单味人参水煎剂,由此推测在加热煎煮过程中发生了人参皂苷的水解转化,结果使原来在单味药中属微量成分的Rg3和Rh1在复方中成为主要成分。血流动力学实验、对心肌的作用和临床疗效观察显示合煎液效果优于分煎液,提示人参皂苷Rg3和Rh1等可能是该方某些药理作用和临床疗效的活性成分。积术丸:采用GC/MS法测定了其制备过程中苍术酮、苍术内酯、羟基苍术内酯和脱水羟基苍术内酯等4种有效成分的含量动态变化,结果发现在炮制时白术中的苍术酮可氧化生成苍术内酯和羟基苍术内酯,而在与枳实组方时苍术内酯和羟基苍术内酯又可还原成苍术酮,说明组方和制剂工艺可以对复方中的有效成分产生质和量的双重影响,使之成为不同于单味药的新体系,产生特定的治疗作用。白头翁汤:汤剂中小檗碱、七叶树碱、七叶树内酯含量较相应的单味药中的含量降低;黄连与方中各味药配伍煎煮,均会产生含小檗碱的沉淀,推测可能是配伍后某些化学成分的存在使小檗碱的溶解度降低而析出。2.复方配伍后产生的新化合物采用植物化学方法,进行中药复方化学成分的提取分离和结构鉴定,系将中药复方视为一个整体,采用现代各种化学方法和色谱技术,对其化学成分进行系统的提取、分离、纯化和结构鉴定。该方法有助于了解复方的化学物质基础,通过与单味药成分的比较,也有可能发现复方配伍后产生的新化合物等。目前有关这方面的研究工作报道不多。例举例如下:四君子汤:从四君子汤复方和单味白术的水煎剂中分得苍术醚、苍术内酯、羟基苍术内酯和脱水羟基苍术内酯等4种化合物,证明四君子汤中白术的主要化学成分没有变化。芍药甘草汤:从中分离得到苯甲酸、甘草苷、芍药苷和甘草酸等11个化合物,上述成分与单味药芍药和甘草所含化学成分基本一致。生脉散:从其水煎剂中分离鉴定了在煎煮过程中产生的新成分5-羟甲基-2-糠醛,并探讨了复方化学成分动态变化与药效之间的关系。白头翁汤:该汤剂主要含有生物碱、香豆素、皂苷、柠檬苦素等4类化学成分,鉴定了其中14个化合物的结构,并与单味药化学成分比较,确定了化合物的来源。3.方外工作及疗效活性筛选与化学分离紧密结合,以药效为指标,追踪分离复方有效部位与有效成分,系根据临床疗效建立与某一病症相对应的药理模型,确定一种或多种药效作用的观测与评价指标,然后对复方及其各种提取分离部位进行活性追踪,确定复方产生某种药理作用的有效部位或有效成分,并分析其质和量的变化与药效的关系,在一定程度上阐明复方组方的配伍规则及疗效机制。此项工作难度大、涉及面广,目前尚处于起步阶段。排脓散:对其进行了提取分离和活性追踪实验,结果提示排脓散对角叉菜胶所致水肿形成的抑制作用,系枳实中的柑桔苷、新橙皮苷和芍药中的芍药苷等有效成分协同作用的结果。二妙散:以2,4,6-三硝基氯苯所致小鼠迟发性变态反应为指标,对二妙散水煎剂进行提取分离,通过对其有效部位进行定性分析,发现生物碱类是起免疫抑制作用的主要活性成分,而醇沉部位虽不含生物碱,但也具有明显免疫抑制活性,提示生物碱类并非免疫抑制的唯一成分。六味地黄汤:以环磷酰胺处理小鼠为药理模型,抗体生成反应为活性评价指标,定向追踪分离得到六味地黄汤发挥免疫调节作用的活性成分为酸性多糖,其相对分子量在5000～40000。十全大补汤:从中追踪分离得到具有促进细胞增殖反应的酸性多糖。小柴胡汤:从中分离获得具有增强NK细胞活性的酸性多糖,分子量1.2×10,其组成单糖摩尔比为鼠李糖:阿拉伯糖:甘露糖:半乳糖:葡萄糖:半乳糖醛酸=1:17:3:21:100:87。三、对复方化学研究的建议关于中药复方化学研究,在研究思路和研究技术方法上,都处于探索阶段。关于中药复方化学研究总体思路,姚新生、石任兵等指出:首先,必须将中药复方作为一个有机整体进行研究;第二,临床主要治疗作用应该和所选择的药理学指标或者生物活性指标大体平行;第三,在探讨复方药效物质基础时,应采取物质分离与活性筛选同步进行的原则,尽可能采用多种活性筛选指标进行评估,以尽快追踪分离得到目标活性成分。第四,在确定了目标活性成分之后,探讨活性成分在复方及其组成的单味药中的分布和含量,阐明各单味中药对复方的贡献大小。同时,在等剂量的条件下进行目标活性成分、单味中药以及复方的药效学对比,探讨复方配伍规律和优化配方。基于上述研究思路,提出中药复方研究的大体程序为:选择目标处方;核定标准处方并确认标准汤剂的药效;建立多指标活性筛选体系对目标成分进行系统评估;追踪分离目标活性成分并确定其化学结构;探讨中药复方药效物质基础及其作用机理;阐明复方配伍规律。孔令义等认为,中药复方化学研究应严格按照中药传统用药方式,重点对其水煎剂进行全面系统研究。在研究过程中紧密结合已建立的能确切反映该复方疗效的动物模型,进行活性跟踪,确定有效部位。建立有效部位的高效液相指纹图谱,并以指纹图谱为依据,应用现代分离技术,在动物模型跟踪下,对有效部位进行系统分离,得到有效成分。由于复方有效成分的多靶性,有时用单一的动物模型不能完全反映复方疗效时,应同时采用多个动物模型进行跟踪筛选,以保证最大限度地反映复方的全面疗效,分离鉴定出复方应用过程中全部的有效成分。还可根据这些有效成分在复方有关单味药中的含量进行配比,在动物模型上进行实验,并和复方药理实验结果比较,确定研究出的有效成分是否全面反映中药复方的药效。阚毓铭则认为研究中药复方药效物质基础和配伍规律应采用逆向思维方法。首先,通过对血清中存在的中药复方化学成分的研究,反向追踪它们的来源。其次,设计最佳提取分离方案,对中药复方或相应单味中药进行定向提取分离。再次,将分离出的各化合物,参考它们在血清中的含量、配比和复方中药剂量,从动物的整体行为到细胞水平进行药理实验评价,筛选研究复方有效成分,研究复方作用机理和配伍规律。关于中药复方化学研究技术与方法,陈耀祖认为中药复方化学研究应重视实验方法学研究。如果在方法学上没有突破,则很难达到预期目标。同时指出色谱法和质谱法是攻克中药复杂体系中分离分析问题的最有力手段,色谱联用技术的开发应用应予以重视,如“免疫亲和萃取-HPLC-ISI-MS-MS在线联用”技术有可能移植于中药复方有效成分筛选。张礼和认为中药复方化学研究应运用先进的分离鉴定技术,如CE、HPLC、MS以及MS/MS联用等,完成中药复方化学成分的快速分离鉴定。另外可以把中药复方化学成分看作一个天然的组合化学库,一些从组合化学库中筛选活性物质行之有效的方法可以借鉴用来研究复方化学成分。例如,可以用生物活性筛选手段(如有荧光标志化合物的受体)直接从库中“钓”出有活性的化合物,或通过类似于亲和层析的方法直接从库中吸附有相互作用的化合物,再通过光谱学方法确定其结构。卢佩章等认为对于中药复方化学研究,采用以液相色谱为主的各种色谱手段,配合质谱和光谱的综合分析,建立中药复方识别指纹和智能统一信息数据库十分重要。即以液相色谱为主的多种色谱手段综合分析中药复方化学组成;建立中药复方的质谱、光谱数据库;利用色谱和质谱、光谱等联用技术进一步进行中药复方化学组成的信息提取、加工,建立中药复方识别指纹和智能统一信息库。高月等设想将分子生物学相关技术及现代分离分析技术应用于中药复方物质基础研究,提出采用多维色谱差异显示技术、基因芯片技术和蛋白质组相关分析技术研究中药复方对细胞基因表达谱和蛋白质表达谱的影响;建立基因芯片及蛋白质组学和生物信息学等技术平台,利用此平台将复方多组分、多靶点、多途径作用特点与基因、蛋白表达关联起来,比较各自不同的表达差异谱、表达的器官特异性及表达水平,阐明复方药效物质基础及配伍规律。四、创新药物的可行性中医药疗效优势和特色主要是通过中药复方来体现的。目前复方中药大多为粗提取物制剂,质量标准难以得到国际社会的认可。因此加大力度将中药复方研制成为有效物质明确、作用机理清楚、临床安全有效、质量稳定可控的创新药物,使其能在国内外医药市场充分显示出优势与特色,是中药现代化的目标之一。以传统中药复方为基础,进行创新药物的开发研制离不开中药复方化学研究。中药复方的特点是组成药味一般较多,成分繁多复杂,常常是一方能治疗多个病或证。中药复方的化学成分可以说是一个化学成分库,若想对这众多的化学成方进行定性定量分析和质量控制,依据现阶段所具备的中药化学成分研究水平和分析手段是难以实现的。即便能够实现,其质量控制又未必有意义。因为中药复方治疗某一病或证时,并非其所含所有化学成分都发挥治疗作用或参与协调作用。如果能够从这一复方化学成分库中将治疗某一病或证的有效部位(群)或有效成分(群)筛选分离出来,并以有效部位(群)为基础,研制出的创新药物既能够符合中医基本理论,又由于剔除了其中大量的无效成分及干扰成分,使药效作用更加具有针对性,主要药效作用更加突出,更能显示出中医药的优势与特色。同时,由于中药复方有效部位(群)中化学成分的有限性,使阐明中药复方有效部位(群)的作用机理、有效成分(群)的化学结构,分离制备相关对照品,建立科学合理的质量控制标准(定性分析、定量分析、指纹图谱的科学表达)等便能切实可行。最终使以复方有效部位(群)为基础研制开发出的创新药物不仅临床疗效明确而肯定,而且药效物质基础和作用机理清楚,质量控制严格、全面而稳定。这样的创新药物才有望被国际社会所认可。实践证明在进行中药复方化学研究基础上,筛选分离中药复方有效部位(群),建立有效部位(群)的质量控制方法及标准,并以此为基础研制创新药物,是实现中药现代化的有效途径。五、有效部位和有效成分的基础研究和应用近年来,我们课题组在中药复方化学研究方面进行了大胆而有益的尝试,先后开展了经典方银翘散、四逆散、黄连解毒汤、葛根芩连汤和时方清脑宣窍方、脑络欣方等的药效物质基础的研究。为建立以现代化学和药理学为基础,能阐明中药复方有效部位(群)组成,有效成分(群)结构、药效及机理的方法,进行了大量的实验与探索。逐渐形成了方-证(病)对应,整方筛选中药复方有效物质基础的总体思路,以及以中药复方有效物质为基础研制创新药物的方法和模式:1.按照传统用药方式,将中药复方视为一个有机整体进行有效物质基础研究。2.结合主要药效考察,筛选确定复方有效部位和有效成分。中药复方虽有多方面的药效作用,但在探讨其物质基础时,不能面面俱到,而应有所侧重。故选择的活性筛选指标,不宜过多和分散,而应该与复方疗效一致,目标明确,重点突出。3.对有效部位、有效成分进行药理研究,阐明其作用机制。4.建立完善的有效部位质量控制方法:“多特征有效指标定量”加“指纹图谱定性”。(1)有效部位中主要类型成分总含量的测定。(2)有效部位中主要有效成分含量的测定。(3)有效部位指纹图谱的建立与定性分析。5.以有效部位或有效成分配伍为基础,进行制备工艺、质量控制方法、药理和毒理研究,完成中药复方创新药物的基础研究。据此,我们对银翘散抗流感病毒作用的物质基础进行了系统研究。取得的主要结果如下:(1)采用鸡胚法、CPE和整体动物法,筛选出了银翘散抗流感病毒有效部位群(EFY)。并利用现代分离鉴定方法对EFY的化学成分进行了系统研究,从中分离得到43个化合物,鉴定了其中的31个。1个为新化合物,8个化合物为首次从银翘散中获得。并对部分单体化合物的抗流感病毒活性进行了测定。(2)首次进行了EFY的HPLC指纹图谱研究,建立了含有30个共有指纹峰的特征指纹图谱。归属了HPLC指纹图谱中主要指纹峰的来源,并采用LC/MS/MS以及加样HPLC测定法,确认了其中主要的指纹峰。(3)对EFY中黄酮类总成分、木脂素类总成分以及其中主要有效成分醉鱼草苷、异甘草素和牛蒡子苷进行了定量分析。并阐明了组方各单味药对EFY的贡献。(4)在药效筛选的基础上,采用CPE抑制实验,根据病毒复制的环节,研究了EFY对3种病毒的预防、治疗和直接杀灭作用,探讨了EFY抗病毒效应的机理。其中研究成果“抗流感病毒的药物有效部位及活性成分的分离制备方法”已申请专利。以银翘散抗流感病毒有效部位群为基础,开展的有关创新药物研究已基本完成。另外,有关四逆散、黄连解毒汤、葛根芩连汤和时方清脑宣窍方、脑络欣方等的有效物质基础的研究也基本完成,并取得了阶段性的研究成果[37,38,39,40,41,42,43,44,46]。目前,已成功地从四逆散中筛选分离出具有多靶点、多途径抗抑郁的有效部位;从葛根芩连汤中筛选分离出抗病毒性腹泻的有效部位;从黄连解毒汤中筛选分离出抗缺血性脑中风(恢复期)的有效部位;从清脑宣窍方中筛选分离出抗缺血性脑中风(急性期)的有效部位,从脑络欣方中筛选分离出抗血管性痴呆的有效部位。并基本阐明了上述各复方有效部位的主要活性成分,建立了各有效部位与主要活性成分的质量评价标准和控制方法,并申请了相关专利。上述研究成果有力地证明了我们提出的中药复方化学研究思路与方法的可行性与可操作性,以及以中药复方有效部位(群)为基础,研制复方创新药物的可行性。六、中药复方化学研究的目的和方法中药复方是按照中医“理、法、方、药”的基本原则和“君、臣、