基于aflp分子标记技术的秦岭秀雅杜鹃遗传多样性及遗传分化研究

基于aflp分子标记技术的秦岭秀雅杜鹃遗传多样性及遗传分化研究

杜鹃花植物具有很高的观赏价值。许多杜鹃品种也是构成高山和亚高山灌木生态系统的重要树种。这是亚高山针叶林和阔叶针叶混交林的主要优势物种或主要伴生物种。它具有极其重要的生态价值，在保护水土和保持生态系统稳定方面发挥着重要作用。秦岭野生杜鹃独特的植物资源丰富，具有很高的观赏价值。具有明显的优势。这是该地区最具潜力的野生植物资源之一。秀雅杜鹃(Rhododendronconcinnum)属于杜鹃花科杜鹃花属,花紫色,具有较高的观赏价值和育种价值,也是秦岭地区的广布种.目前,该地区对秀雅杜鹃资源滥采滥挖的现象随处可见,这种人为采集和干扰使杜鹃花的生境遭到严重破坏,种群数量急剧减少,秀雅杜鹃资源流失严重,必须立即采取必要的保护措施.不同物种的多样性水平和群体遗传结构有很大的不同,因此,对一个物种采取什么样的保护策略和措施,必须建立在对该物种群体遗传学研究的前提下.尤其是针对稀有和濒危的物种以及受人类直接干扰和破坏的物种,在缺乏基本遗传学信息的情况下,很难制定科学合理的保护和抢救措施.在对物种实施保护的过程中,原位保护地点的选择和迁地保护策略都需要遗传学资料作为基础.物种的遗传多样性既是维持其繁殖活力和适应环境变化的基础,也是其他一切多样性的基础和最重要部分,由于种群的遗传多样性水平在相当程度上制约了其对环境的适应能力,因此可预测这个种群的发展趋势.了解物种的遗传多样性和群体的遗传结构,可为物种的保护和利用提供重要的理论依据.通过开展杜鹃花资源的遗传多样性研究来实施种质资源的保护逐渐成为各国杜鹃花资源研究的一个热点.目前,国内对杜鹃花遗传多样性和遗传分化的研究很少,2005年在文献中始见相关报道.所采用的技术主要有水平淀粉凝胶电泳技术、随机扩增多态性DNA技术(RAPD)、ITS技术和内部简单重复序列技术(ISSR).与其他植物相比,所涉及的分子标记类型比较少,在研究的广度和深度上都有较大差距.由于RAPD技术重现性较差,同工酶技术测得的遗传多样性偏低,ISSR分子标记无法区分杂合体和纯合体,不能从带型数据直接估算等位分子标记频率,因此,在物种基因组信息未知时,AFLP分子标记技术成为目前研究群体遗传和亲缘关系最好的分子标记技术之一.很多观赏植物,如蜡梅(Chimonanthuspraecox)、牡丹(Paeoniasuffruticosa)、红花玉兰(Magnoliawufengensis)等都利用该技术开展了相应的遗传多样性研究.在国外,AFLP分子标记技术也已经被用于对杜鹃花属植物同种不同环境的种群分析和不同种的遗传分化分析.由于杜鹃花种质资源的来源不同,其遗传关系也可能不同.目前,国外对杜鹃花资源已开展了AFLP研究,但对于我国的杜鹃花种质资源尚未见AFLP研究的报道.为此,本文利用AFLP分子标记技术对秦岭地区的秀雅杜鹃种质资源进行遗传多样性分析,旨在从分子水平上研究秀雅杜鹃种内不同种群间的遗传多样性和遗传分化,从而提出秀雅杜鹃种质资源的保护策略,为杜鹃花属其他物种遗传多样性研究和资源保护提供参考.1材料和方法1.1植株采集和处理试验于2011年3—8月在西北农林科技大学旱区作物逆境生物学省级重点实验室进行.供试的秀雅杜鹃叶片采集于秦岭山区陕西段的宝鸡、西安、汉中和商洛等4个市的7个县,具体位置见图1.各秀雅杜鹃种群名称、样品数量、气候因子和地理因子等见表1.采样时不同植株个体间隔海拔距离>5m,每个种群选取10~25株个体,选取新鲜的幼嫩叶片,用自封袋装好,尽快带回实验室于-70℃冰箱中保存,备用.1.2总dna的提取采用北京天根生化科技有限公司提供的植物基因组DNA试剂盒提取总DNA,用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,选取带型清晰、无拖尾的DNA样品,用超纯水(ddH2O)稀释到50ng·μL-1,于-20℃冰箱中保存备用.1.3pcr扩增检测参照Vos等的方法进行AFLP试验,略有修改.试验所需MseI和EcoRI接头及引物由北京奥科生物科技有限公司合成,所需的限制性内切酶MseI和EcoRI以及连接酶T4DNA由NEB(NewEnglandBioLabs)公司提供.DNA电泳分子量标准为PBC19DNA/MspI(HPaII)marker23(34~501bp),由沃尔森公司提供.1.3.1pcr检测dna25μL的酶切连接体系为5.0μLDNA(100~500ng)、0.25μLEcoRI(10u·μL-1)、0.25μLMseI(10u·μL-1)、0.5μLEcoRI接头(5pmol·μL-1)、0.5μLMseI接头(50pmol·μL-1)、0.5μLATP(10mmol·L-1)、2.5μL1xNEB缓冲液、0.1μLT4DNA(5units·μL-1)和15.4μLddH2O.在PCR仪上37℃反应3h,构建成预扩增模板DNA.1.3.2选择性pcr反应预扩增的反应体系:20μL体系中含有酶切连接后模板5.0μL、0.6μLEcor引物(50ng·μL-1)、0.6μLMse引物(50ng·μL-1)、0.4μLdNTPs(10mmol·L-1)、1.2μLMg2+(25mmol·L-1)、2.0μL10xPCR缓冲液和0.2μLTaq聚合酶(5u·μL-1).PCR反应程序:94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸60s,共24个循环.在20μL预扩增产物中加入180μLddH2O进行10倍稀释,作为下一步选择性扩增反应用的工作液.选择性扩增的反应体系:20μL体系中含有预扩增产物10倍稀释后模板5.0μL、1.0μLMse引物(50ng·μL-1)、1.0μLEco引物(50ng·μL-1)、0.4μLdNTPs(10mmol·L-1)、1.2μLMg2+(25mmol·L-1)、2.0μL10xPCR缓冲液和0.2μLTaq聚合酶(5u·μL-1).选择性扩增PCR反应程序:94℃变性30s,65~56℃退火30s,每个循环降低0.7℃,72℃延伸60s,共12个循环.然后94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸60s,共24个循环.所有PCR扩增反应均在德国Eppendorf生产的PCR仪上进行.1.3.3电泳检测方法PCR反应结束后,在20μL反应体系中加入8μL加样缓冲液,在PCR仪中95℃8min后迅速放冰上进行变性,然后用于电泳检测.采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行检测.银染后的板在X线胶片观察灯下观察.所使用的DXY-12型电脑三恒多用电泳仪和电泳槽为北京六一仪器厂生产.1.4遗传多样性及聚类分析对扩增产物的电泳结果采用“0-1”数据记录谱带位置,观察电泳图谱中同一位置上DNA带的有无,有记为1,无记为0,形成0/1数据矩阵.在假定种群处于Hardy-Weinberg平衡状态下,采用POP-GENE1.31软件计算种群遗传多样性参数:多态位点百分率(PPL)、有效等位基因数(Ne)、Nei的基因多样性指数(h)、Shannon信息指数(I)、遗传分化系数(Gst).采用AMOVA1.55软件进行分子方差分析,计算反映种群遗传结构及变化的平方和、均方、方差分量等,根据计算出的各参数分析秀雅杜鹃各种群的遗传变异规律.采用NTSYS-PC2.1软件对种群进行非加权算术平均聚类分析,得出各种群间的聚类分支图.2结果与分析2.1筛选引物并筛选引物AFLP技术与RAPD技术一样,用的是通用型引物,但不是所有的引物组合都能很好地扩增并且多态性高,不同的引物组合对扩增条带有明显的影响,多态性和稳定性好的引物是进行全部基因组扩增成败的关键.所以,具体到某一材料,应根据其基因组的具体情况在大量引物中筛选才能得到理想的结果.由于缺乏有关秀雅杜鹃基因组信息的资料以及相关的AFLP的文献,本试验以7个秀雅杜鹃种群的混合样品为试材筛选引物,采用128对引物作为初选引物,从中筛选出了10对能扩增出带型分布均匀、多态性高且分辨能力强的引物,其引物序号分别为:M52E41、M52E35、M62E46、M64E94、M49E41、M64E46、M41E46、M48E35、M50E36和M50E40.从选择出的10对分辨能力强、多态位点高的引物中选出3对分别对7个种群134个个体进行扩增,共扩增出182条DNA片段,其中151条是多态的,占扩增总片段数的83.1%.每对引物扩增出的DNA片段数为54~67个,平均60.7个,这些DNA片段大小主要集中在67~501bp.不同引物扩增出来的片段数不同,其中64—94号引物扩增出的DNA片段最多,共67条;52—41号引物扩增出的DNA片段最少,只有54条(图2和表2).2.2群落遗传多样性有效等位基因数(Ne)、Nei的基因多样性指数(h)、Shannon信息指数(I)、多态位点百分率(PPL)是度量遗传多样性水平的常用指标.对秦岭秀雅杜鹃7个野生种群的群体遗传学进行分析,从表3可以看出,不同种群之间多态位点百分率存在一定的差异,秀雅杜鹃7个种群的多态位点百分率为68.41%~86.13%,其中,眉县太白山种群多态位点百分率最高,周至黑河种群多态位点百分率最低.在种群水平上,Shannon信息指数的变化趋势与Nei的基因多样性指数基本保持一致,说明这2种指数所揭示的秀雅杜鹃遗传变异规律是一致的,均表现为眉县太白山种群最高(h=0.4948,I=0.6878),周至黑河种群最低(h=0.4377,I=0.5957).秦岭秀雅杜鹃7个野生种群的h在0.4377~0.4948,I在0.5957~0.6878,种群间的遗传分化系数(Gst)为7.26%,表明来自秦岭地区的7个秀雅杜鹃种群间均存在一定程度的遗传分化,种群间的遗传变异为7.26%,种群内的遗传变异为92.74%.秀雅杜鹃物种水平和种群水平的I分别为0.7217和0.6409,h分别为0.5095和0.4725,同样说明种群间遗传多样性小于种群内遗传多样性,秀雅杜鹃遗传多样性主要存在于种群内部.2.3秀雅松茸的遗传多样性种群遗传变异的AMOVA分析表明,秦岭秀雅杜鹃7个野生种群间存在一定程度的遗传分化,在总的遗传变异中,85.3%的变异发生在种群内,14.7%的变异发生在种群间,说明秀雅杜鹃种群内、种群间均产生遗传变异,而种群内的变异是秀雅杜鹃的主要变异来源(表4).此结果与Nei的基因多样性指数和Shannon信息指数分析结果一致.2.4不同性状聚类分析为了进一步分析7个秀雅杜鹃种群间的遗传分化程度,利用POPGEN计算了Nei的遗传距离和遗传一致度.从表5可以看出,7个秀雅杜鹃种群间的遗传一致度在0.7965~0.9274.其中,柞水种群与眉县种群的遗传相似度最高,柞水种群与宁强种群最低.种群间的遗传距离在0.0745~0.2278,柞水种群和宁强种群的遗传距离最大,柞水种群与眉县种群最小.根据各群体之间的遗传距离,采用NTSYS-PC2.1软件对7个秀雅杜鹃种群进行UPGMA聚类分析,建立遗传关系聚类树状图.由图3可以看出,7个秀雅杜鹃种群的遗传距离都>0,又能聚在一起,表明7个野生种群之间既有相同的遗传背景,又存在一定的差异.其中,柞水种群和眉县种群的遗传距离最近,说明这2个地区的秀雅杜鹃具有较近的遗传距离;汉中地区的南郑种群和宁强种群相距较近,遗传距离较小,并与其他5个种群保持着相对较远的遗传距离,这与其地理分布格局基本吻合;眉县种群和周至种群的地理距离较近,但没有优先聚在一起,说明种群间的遗传分化程度与种群间的地理距离并没有明显的相关性.Mantel检验结果也表明,7个秀雅杜鹃种群间的遗传距离和地理距离之间相关性不显著.南郑种群和宁强种群与其他5个种群之间的遗传距离相对较大,可能是因为这2个种群位于陕西、四川和重庆交界处,而其他5个种群完全位于陕西秦岭山脉的主脉上,不同的气候环境可能造成这2个种群与其他5个种群间显著的遗传分化.3讨论3.1种群遗传多样性扩增片段长度多态性(AFLP)是一种高效的分子标记方法,近几年AFLP技术被广泛应用于植物分类、亲缘关系探讨和遗传多样性研究等方面.该技术不但具备其他DNA分子标记,如RFLP、SSR、RAPD和ISSR所具有的优点,而且一次分析可获得基因组大量的遗传信息,特别对具亲缘关系及遗传上区别不大的种类来说是比较合适的分子标记方法.因此,AFLP分子标记可以用于杜鹃花属植物遗传多样性和遗传分化研究.秦岭是我国南北气候的分界线,植物区系成分具有明显的过渡性、混杂性和复杂多样性.杜鹃花属是秦岭木本植物区系中比较重要的属之一,也是秦岭地区最具开发价值的园林植物种类之一,秀雅杜鹃是秦岭杜鹃花属中分布较广、观赏价值较高的一个种.本文利用AFLP分子标记技术对秦岭秀雅杜鹃野生资源的遗传变异进行分析,可以为杜鹃花属其他种类的遗传多样性研究提供参考.本研究中,利用AFLP技术分析发现,7个秀雅杜鹃种群中所检测的多态位点百分率、有效等位基因数、Nei的基因多样性指数和Shannon信息指数的变化趋势一致,其排序为眉县种群>柞水种群>镇安种群>户县种群>宁强种群>南郑种群>周至种群.这可能与种群的地理分布区域的大小有关系.一般来说,地理分布范围较小,昆虫可以到达种群内部的每个植株,种群内部的传粉比较容易进行且近交频繁,从而降低了其遗传多样性水平,而对于比较大的种群,昆虫不能到达所有个体,基因交流不频繁,导致种群内产生遗传分化,出现较高的遗传多样性.调查中发现,在眉县、柞水和镇安等地,秀雅杜鹃成片分布,尤其是眉县种群秀雅杜鹃的分布面积最大,数量最多;而在南郑种群和周至种群,秀雅杜鹃仅是零散分布,分布面积和数量均较小.AFLP分析表明,秦岭地区秀雅杜鹃物种水平的多态位点百分率为91.22%,Shannon信息指数平均为0.7217,Nei的基因多样性指数平均为0.5095;种群水平的多态位点百分率为77.56%,Shannon信息指数平均为0.6409,Nei的基因多样性指数平均为0.4725,说明秦岭地区秀雅杜鹃在物种水平和种群水平上都具有较高的遗传多样性,这与其他6种产自中国香港地区的杜鹃花属的研究结果一致.遗传结构是指遗传多样性在种群内和种群间的分布及遗传分化.不同物种在遗传结构和遗传分化上的差异很大.秦岭地区秀雅杜鹃在各地的有效规模较小,导致群体之间发生遗传分化;另外由于山脉地形的分割,导致群体之间彼此隔离,可能进一步促使群体间的遗传分化.此外,基因流也是促使群体遗传分化的主要因素之一,在植物中,花粉、种子的扩散和传播是基因流的2种主要形式.秦岭地区秀雅杜鹃生长海拔较高,可供传粉的昆虫的种类和数量有限,因此多依靠风媒传粉,但秀雅杜鹃植株大多低矮,且生长于混交林的中、下层,风的驱动能力较弱,导致花粉的传播距离受限,因此影响了不同群体间的基因交流,导致遗传分化的出现.POPGENE分析结果表明,秀雅杜鹃物种水平的多态位点百分率、Nei的基因多样性指数和Shannon信息指数均高于种群水平,表明秀雅杜鹃种群内的遗传多样性大于种群间,说明秀雅杜鹃遗传多样性主要存在于种群内部.AMOVA分析也表明,秀雅杜鹃种群内的遗传变异大于种群间,2种方法所得遗传分化结果差异不大.Chappell等对美国羊踯躅亚属的7种落叶杜鹃花的研究表明,7种杜鹃花的遗传变异主要发生在种群内,种群间的遗传变异仅占14%.因此,从育种的角度来看,从不同地理区域选择单株不一定比从同一种群内部选择单株进行杂交得到更高的等位基因多样性.根据遗传距离对7个秀雅杜鹃种群进行UPG-MA聚类,结果表明,秀雅杜鹃种群间的遗传分化程度与种群间的地理距离没有明显的相关性.而有研究表明,一些物种如长叶榧(Torreyajackii)种群间的遗传距离和地理距离呈显著正相关.3.2关于菊花的救助目前,我国秦岭地区的秀雅杜鹃资源破坏十分严重,一方面,道路修建中大量的土石工程对沿途的秀雅杜鹃资源造成无法挽回的损失.另外,由