柴胡疏肝散对抑郁症模型大鼠海马乙酰胆碱代谢的影响

柴胡疏肝散对抑郁症模型大鼠海马乙酰胆碱代谢的影响

抑郁是一种复杂的精神障碍。自发现以来，抗抑郁药物的主要药物是5-羟色胺选择性抗抑郁药。然而，在临床试验中，类抗抑郁药物的有效性为60%-80%，临床治疗效果延迟，胃肠道副作用严重，患者随访率高。所以,各国学者开始把注意力转向与情绪相关的另一重要的中枢神经递质乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)。本课题通过观察抑郁模型大鼠海马组织ACh代谢变化及柴胡疏肝散的干预作用,进一步探讨抑郁症的发病机制和柴胡疏肝散抗抑郁症作用的理论机制。试剂与仪器4-5月龄清洁级SD雄性大鼠60只,体质量360-380g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证编号:SCXK(京)2007-0001。SYBR®ExScript™RT-PCRKit(PerfectRealTime)、RNAisoReagent、磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehydesphosphatedehydrogenase,GAPDH)与胆碱乙酰化酶(cholineacetyltransferase,ChAT)引物合成(宝生物工程有限公司);免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);(acetylcholinesterase,AChE)乙酰胆碱酯酶与考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程有限公司);柴胡疏肝散饮片(黑龙江省中药材公司),饮片按柴胡:枳壳:白芍:川芎:炙甘草:香附:陈皮为6:5:5:5:3:5:6的比例,冷水浸泡药材2h,常规两煎,第1次1.5h,第2次1h,两次水煎液混合并过滤,经水浴蒸发浓缩成含生药0.7g/mL的浓缩药液,高压灭菌后冷藏备用;盐酸氟西汀胶囊(中美合资中化药品工业有限公司)。ABI7300荧光定量PCR仪(美国ABI公司),Safire2高速多通道连续波长酶标仪(奥地利TECAN公司),AlphaImager™图像分析系统(美国Alphaimager公司)。动物分组、给药与测定适应性喂养1周后。通过敞箱实验筛检,大鼠随机分为正常组、模型组、西药组和中药组,每组15只。模型组、西药组和中药组单笼饲养,进行21d慢性轻度不可预见性应激刺激(chronicunpredictablemildstress,CUMS):电击足底(电流强度1mA,电压45mV,10s/次,间隔1min,共30次)、冰水游泳(4℃,5min)、摇晃(1次/s,15min)、夹尾(3min)、热应激(45℃,5min)、禁食+噪声、禁水+异物、昼夜颠倒、束缚(8h)、禁食+潮湿垫料(每100g垫料中加入200mL水)与禁水+倾斜鼠笼。每天随机安排1种刺激方式,每种刺激在实验过程中使用不超过3次。正常组大鼠不予任何刺激,每5只1个笼子饲养。造模同时,中药组按2mL·kg-1·d-1灌胃给予柴胡疏肝散,每日1次,连续21d。西药组按1.2mg·kg-1·d-1灌胃给予盐酸氟西汀,每日1次,共21d。Open-field-test测定方法:实验装置为高40cm、底边长80cm、周壁涂黑、底板为白色的无盖方箱,底板用黑线划成16cm×16cm的25个方格。将大鼠轻放于方箱底板中心,每只动物单独进行测定,每次测定时间为3min。计分方法:以大鼠穿越底面格数为水平活动得分,大鼠4只脚均在同一格子内为一格,穿越一格计1分,如大鼠沿线行走,以每10cm为1分;以大鼠直立次数为垂直活动得分,双足离开底面为标志。糖水偏爱度的测定:24h的禁食禁水后,测定1h动物饮用1%蔗糖水和纯水的量,然后应用公式:1%蔗糖水消耗量/(1%蔗糖水消耗量+纯水消耗量)×100%,计算出各组大鼠糖水偏爱度值。行为学测试后,灌注固定,断头取脑,分离海马,固定,包埋,切片,加抗体,显色,复染,脱水,封片,光镜下观察并用MoticMed6.0数码医学图像分析系统计算积分光密度。按照南京建成生物工程公司提供的试剂盒测定AChE。所有数据运用SPSS13.0软件包进行处理,数据以表示,组间比较采用单因素方差分析。结果1.对抑郁症大鼠海马区ache表达的影响表1结果表明,实验前各组大鼠体质量无显著性差异;造模第14d,与正常对照组相比,模型组体重增长明显降低(P<0.05);造模第21d,与正常对照组比较,模型组体重继续降低(P<0.01),与模型组比较,西药组、中药组体重增长加快(P<0.05)。表2结果显示,实验前各组大鼠的糖水偏爱度相同;造模第14d,与正常对照组相比,模型组、西药组和中药组糖水偏爱度明显降低(P<0.05);造模第21d,与正常对照组相比,模型组糖水偏爱度继续降低(P<0.01),与模型组比较,西药组和中药组糖水偏爱度水平显著升高,具有极显著性差异(P<0.01)。由表3和表4可知,实验前各组大鼠活动度水平无显著性差异;应激刺激7d后,与正常对照组相比,模型组水平运动及垂直运动均明显减少(分别为P<0.05,P<0.01),持续经历21d刺激后,水平运动与垂直运动差异更明显(P<0.001)。与模型组相比,西药组、中药组水平运动次数、垂直运动次数始终升高(P<0.05-0.001)。说明慢性不可预见的轻度刺激对大鼠的行为有着肯定的影响,随着刺激时间的延长,抑郁的程度在逐渐加重。氟西汀和柴胡疏肝散的治疗可以明显改善抑郁症状。见图1-图4。各组积分光密度比较,与抑郁症模型组比较(15.56±3.81),对照组大鼠海马区ChAT蛋白表达显著升高(7.43±2.17)(P<0.05);与模型组比较,西药组、中药组ChAT蛋白表达均明显降低(分别为8.27±2.69、8.42±3.05)(P<0.05)。各组积分光密度比较,与抑郁症模型组比较(14.04±3.67),正常组大鼠海马区AChE蛋白表达显著升高(7.67±1.45)(P<0.05);与模型组比较,西药组、中药组AChE蛋白表达明显降低(7.85±1.52、8.29±2.06)(P<0.05)。见表5。表5结果显示模型组ChAT2-ΔΔCt值显著高于正常对照组(P<0.05),表明模型组ChATmRNA表达上调;与模型组比较,中药组和西药组ChAT2-ΔΔCt值显著降低(P<0.05),表明ChATmRNA表达下调。1.动物2.试剂和药物3.仪器1.动物组2.模型方法3.给药方法4.抑郁模型中的大鼠行为5.免疫组化法测定了ache和chat的蛋白发现6.r-pcr检测chatmnmsra7.采用比色法测定了ache活性8.统计方法见表1-表4。2.各组大汗船区域ache和chat蛋白表达的比较3.各组大鼠马匹区域内的chatm非营利值的比较4.各组大鼠马匹活动的ache活性的比较见表6。模型组大鼠海马区AChE活性明显升高(P<0.05);与模型组比较,西药组、中药组AChE活性明显降低(P<0.05)。抗抑郁症患者药物代谢特征本实验利用孤养结合CUMS制造抑郁症模型。经过21d刺激后,模型组大鼠的水平运动次数,垂直运动次数,糖水偏爱度与体质量均较对照组明显下降。模型组大鼠体现出的这些生理、行为学的变化表现为兴趣丧失、快感缺乏、精神运动迟滞及体质量增长缓慢等,这与抑郁症临床诊断中的抑郁症核心症状及主要躯体症状有相似性,提示了该模型的成功,并为下一步研究抑郁的发病机制提供了实验平台。自1972年Janowsky提出抑郁症胆碱能与肾上腺素能平衡失调学说后。各国学者相继开始了抑郁症胆碱能发病机制的研究与探索,发现拟胆碱药毒扁豆碱可致抑郁,烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinicacetylcholinereceptor,nAChR)拮抗剂可显著缩短悬尾实验和强迫游泳实验中小鼠的不动时间,并呈剂量依赖性特点;nAChR拮抗剂与抗抑郁药有协同作用,能增强抗抑郁药的功效;对抑郁病人的缓解期及其未患病的一级亲属,胆碱能激动剂或抗胆碱酶抑制剂可以明显缩短快波睡眠潜伏期及加重抑郁;对抑郁病人的瞳孔动态特性检测后发现,抑郁病人存在去甲肾上腺能和胆碱能缺陷。这些研究结果均揭示:抗胆碱能剂可以提高情绪,然而胆碱能剂可以改善躁狂或诱导抑郁,抑郁症患者存在着胆碱能功能的异常。本实验中发现,与对照组相比,抑郁症模型大鼠海马ChAT与AChE表达与活性明显升高,提示抑郁症模型鼠脑海马胆碱能神经系统ACh代谢亢进。因为ACh的含量是由ChAT和AChE共同调节的,ChAT与AChE活性的比值(ChAT/AChE)可间接反映乙酰胆碱的含量。所以,推测抑郁症模型大鼠大脑海马胆碱能神经系统功能亢进。临床上应用柴胡疏肝散治疗抑郁症,已经取得非常显著的疗效,并且副作用少,复发率低。药理研究已经证实柴胡疏肝散在产生显著抗抑郁疗效的同时,柴胡疏肝散能抑制应激导致大鼠促肾上腺皮质激