西洋杜鹃组织培养研究

西洋杜鹃组织培养研究

西方杜鹃是杜鹃中最具花的品种，有2000多种。随着人们生活水平的提高，对其的需求越来越大。然而，西方杜鹃的传统繁殖方式很少，繁殖体系较低，阻碍了引进西方杜鹃和推广良种的过程。因此，西方杜鹃的快速繁殖技术是非常必要的。我国从80年代初开始杜鹃花组织培养方法的研究,但进展较慢,目前仅见杨乃博、陈振光、董春枝等人对春夏鹃、锦绣杜鹃和西洋杜鹃少数品种进行了研究,且多局限于杜鹃花组织培养再生植株的某些环节,缺乏进一步深层次的研究,缺乏系统性,多篇报道仅以简报形式出现。本实验力求从保持品种遗传特性、避免变异角度考虑,着重研究西洋杜鹃茎尖再生植株技术环节,筛选出最优技术参数组合,建立西洋杜鹃最优再生系统。1材料和方法供试材料为四川农业大学园林系盆栽1~1.5年生西洋杜鹃。1.1母株预处理早春摘去西洋杜鹃花芽,促其多萌发新梢,能够提供较多的外植体。1.2制备培养低保液取2cm左右长的新发幼茎,除去一部分较老叶片,用自来水冲洗2~4h,无菌条件下经70%的酒精漂洗15~30s,无菌水冲洗1次,转入0.1%HgCl2溶液消毒6~8min,无菌水冲洗5次,最后放入无菌培养皿中备用。1.3培养基的选择试验旨在确定合适的基本培养基类型,以MS、改良MS、1/4MS、Read、Anderson5种杜鹃花组培常用的培养基为培养基,附加ZT(0.5),NAA(0.05)。各种培养基均含蔗糖3%,琼脂0.6%,pH5.4。1.4培训条件温度25±2℃,光照16h/黑暗8h,光照强度1500~2500lx。2结果与分析2.1不同基本培养基对植物基因型的影响基本培养基是植物组织培养重要的基质,由于各种植物的遗传特性,生物学特性和生态学特性不一样,因而各种植物需求的营养成分也不尽相同,对培养基成分要求也有差异。因此,选择合适的培养基类型对于植物组织培养成败至关重要。本实验采用MS(高盐,NH4+/NO3-=0.5),改良MS(高盐,NH4+/NO3-=1),1/4MS(低盐,NH4+/NO3-=0.5),Anderson(中盐,NH4+/NO3-=0.7)和Read(低盐,NH4+/NO3-=1)5种比较有代表性的用于杜鹃花组织培养的基本培养基。尽管这5种培养在许多方面存在差异,但主要的区别在于培养基的总盐量及铵态氮和硝态氮的比值。结果表明(表1):基本培养基以Read效果为最好,在该培养基上,外植体不仅生长良好,还可以分化出较多的幼芽,其次为Anderson,在1/4MS培养基上材料仅能存活,而在改良MS及MS上,外植体叶片变脆、易落,生长衰弱,濒临死亡。分析几种基本培养基对西洋杜鹃茎尖分化产生差异的原因,可以认为在其它相同条件下,培养基的总盐分浓度以及NH4+/NO3-比值对分化效应起着关键作用。本试验中,低盐分浓度及高比值的NH4+/NO3-适合西洋杜鹃,Read培养基即属该类型培养基,这和杜鹃花组织培养多选用低含盐量的培养基的结论是一致的。外植体生长势中+:好;0:不变;-:差;--:濒死。2.2洋树林种子下胚轴为外植体的培养与应用效果外植体供体植株的年龄、发育阶段、生长环境和外植体取材部位不同可导致外植体生理生化状态差异,从而影响组织培养的形态发生。杜鹃花组织培养快速繁殖采用的外植体种类较多,包括茎尖、种子、花芽等,即使是同一类型的外植体,结果也不尽一致。陈云志茎尖培养成功率只有4%~5%,转而采用种子下胚轴为外植体。本试验采用茎尖培养,效果较好,与董春枝的锦绣杜鹃茎尖培养结果相似。在茎尖与茎段对比试验中,茎尖无论在生长势与分化率方面都较优。虽然茎尖与茎段都为同一类型的材料都含芽原基,但效果差异较大,可能因为茎尖从形态结构上比茎段更趋于完整,具有更强的感受态。吴克贤研究长白落叶松组培结果也表明,茎尖分化芽的能力最高,而茎段未出现分化。本试验同时采用顶芽、侧芽为外植体,结果表明,顶芽的效果优于侧芽,这也和吴克贤的结论一致。从外观形态上看,西洋杜鹃顶芽粗壮,长势旺,侧芽细小,长势弱些,可以认为这两类外植体在内源激素与养分等方面存在异差,其感受态也不一致,从而影响芽分化。因此,西洋杜鹃组织培养以顶芽茎尖为外植体为好。西洋杜鹃系灌木多丛枝,可提供较多顶芽,完全能够满足组织培养所需外植体。2.3最佳不同一月五月内容测定取材季节对培养效果也有显著影响,本试验在3月、5月、7月进行重复试验。在3~5月取材时,植物处于生长旺盛期,细胞分裂强裂,带菌少,表现为外植体粗壮、长势快,易消毒,接种后生长能力强,不容易发生褐变,反应明显。相反,在7月取材时,顶芽瘦小,外被绒毛多,消毒困难,也容易褐变。因此,最佳取材时间为3~5月。这与大多数植物应在生长开始的季节取材较好,在生长末期或已进入休眠期采样,外植体在培养中反应迟钝或不能培养成功的结论是较为一致的。3植物的nh4+NH4+/NO3-比率和总N(盐)水平有影响器官形成的作用。一般认为,硝态氮作氮源,作用温和,效果更为理想。所以,绝大多数培养基配方和绝大多数植物组织培养所要求的NH4+/NO3-比率较低,甚至不含NH4+。而成功的杜鹃花组织培养几乎都提高了NH4+水平。其原因是否在于植物对盐的吸收是有选择性的,即一种盐的阴阳离子以不等量进入植物体,其结果势必造成细胞内外的电势差。植物在选择吸收离子时为了维持内外电势平衡采取以下方式:植物在呼吸中产生的HCO3-和H+和需要的离子进行交换,H2O解离成H+和OH-也可用来进行离子交换。另一种可能方式是被选择吸收的离子与外液中H2CO3和H2O解离后的异号离子(H+,HCO3-,OH-)相伴进入植物细胞。由于离子的选择吸收