Chapter-1-高效液相色谱法原理解析

沃特世科技〔上海〕

地址：上海市浦东新区张东路1387号41栋熊莺客户培训师Mail:HPLC根底液相原理名目历史色谱法原理液相色谱系统HPLC参数与术语分别度公式固定相与物理性质了解范氏方程色谱柱色谱的定义是一种分别科学在液相或气相中使化合物到达分子水平的分别Chromato--颜色Graphy--图像首先在俄国科学家Tswett(茨维特)的试验中进展了描述样品－植物提取物他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管，再参与石油醚使其自由流下，结果色素中各组份相互分别形成各种不同颜色的谱带化合物得以分别色谱法简介色谱法〔Chromatography〕溯源100多年前俄国植物学家Tswett〔茨维特〕分别植物色素时承受的试验方法Tswett用希腊语chroma〔色〕和graphos〔谱〕描述他的试验方法，即现在的Chromatography〔色谱法〕Tswett的色谱系统色谱进展史回忆1903－1906Tswett首次使用这套色谱系统1930－1932Karrer,Kuhn和Strain用氧化钙、氧化铝和氧化铁做吸附剂1941Martin和Synge引入了柱分别色谱1944Gonsden,Gorrdon和Mardin介绍了纸分别色谱1951Kirchner引入了我们现在仍在使用的TLC1952James和Martin进展了气相色谱1964进展了现在仍在使用的凝胶渗透色谱〔GPC〕1968高效液相色谱消逝了色谱法简介色谱法的原理是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解，安排，吸附等化学作用性能的差异，当两相作相对运动时，使各组分在两相中反复屡次受到上述各作用力而到达相互分别。两相中有一相是固定的，叫作固定相(StationaryPhase)，有一相是流淌的，称为流淌相(MobilePhase)，流淌相又叫洗脱剂,溶剂。相〔Phase〕：物理化学术语，特指在某一系统中，具有一样成分及一样物理、化学性质的均匀物质局部。各相之间有明显可分的界面。色谱法原理色谱法原理分别是一个物理过程。固定相(StationaryPhase)流淌相(MobilePhase)进样(Injection)洗脱(Elution)相互作用(Interaction)依据分子量区分的色谱类型气相色谱液相色谱吸附/分别液相色谱离子交换体积排解色谱凝胶渗透/凝胶过滤HPLC的系统

溶剂(流动相)

泵进样器

色谱柱(固定相)检测器废液数据系统什么是色谱图？色谱图〔Chromatogram〕：色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为时间←色谱峰时间(分)基线↓峰高峰宽响应值术语–流淌相在HPLC中流淌相是液体全部要分析的样品必需能溶解在流淌相中带着样品与固定相做相对运动术语–固定相色谱填料－它在色谱柱里处于固定位置执行化学分别也被称为色谱填料或吸附剂固定相与流淌相固定相与流淌相具有相反的性质，正是由于这种性质的差异使他们对所分析的化合物具有竞争性液相色谱图名词术语(1)色谱图名词术语:色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号峰底(PeakBase):峰的起点与终点之间连接的直线峰高(PeakHeight):峰最大值到峰底的距离切线峰宽(PeakWidth):在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离半(高)峰宽(PeakWidthatHalfHeight):通过峰高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧相交两点之间的距离液相色谱图名词术语(2)色谱图名词术语:峰面积(PeakArea):峰与峰底之间的面积,又称响应值标准偏差(σ)(StandardError):0.607倍峰高对应峰宽的一半拖尾峰(TailingPeak):后沿较前沿平缓的不对称峰前伸峰(LeadingPeak):前沿较后沿平缓的不对称峰鬼峰(GhostPeak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰液相色谱图名词术语(3)色谱图名词术语:基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流淌相所产生的响应信号基线飘移(BaselineDrift):基线随时间定向的缓慢变化基线噪声(N)(BaselineNoise):由各种因素所引起的基线波动谱带扩展(BandBroadening):由于纵向集中,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象色谱参数V-保存体积V0-死体积tr-保存时间k’–保存因子或容量因子-选择或分别因子N–塔板数w-峰宽R–分别度洗脱体积和峰宽这些是导出理论和定义所必需的根本测量V0=无保存化合物的洗脱体积,等于一个柱体积V1=化合物1的洗脱体积V2=化合物2的洗脱体积W2=化合物2的峰宽(以体积计)，用切线法计算容量因子〔保存因子，k’〕：保存力气的量度k

是样品与填料作用强度的直接量度

V0V1

V2V3

时间.5125描述了峰距离V0有多远与流速、时间和柱子尺寸无关容量因子k’k’与组分在流淌相和固定相之间的平衡有关k’是一个平衡常数在正相与反相色谱中的容量因子k’容量因子的大小取决于流淌相和固定相的极性可以通过转变流淌相中有机相的比例来转变流淌相的极性只适用于吸附和安排色谱通过转变流淌相的极性转变k’分别因子〔选择因子，〕：峰分别程度的量度

V0V1

V2V3

时间.5125

1,2

1,3相邻两个峰k’值的比值描述的两个峰的相对位置取决于系统的“化学”属性α是两个化合物在同一套色谱系统上保存差异的数值表述分别因子〔〕的影响因素－流淌相取决于流淌相的“化学”性质，即选择不同的有机相分别因子〔〕－固定相分别度〔R〕的定义式简洁说来,分别度即是两峰相对于其峰宽分开得有多远R:分别程度的量度此处是几个计算分别度的实例

t0t1

t2t3时间.5125理论塔板数〔N〕：柱效的量度理论塔板数计算公式：

W σ

方法

Wtan 16 切线法

Wh 5.54 半峰高W3σ 9 3σW4σ

16

4σW5σ

25

5σ理论塔板数〔N〕:分别效率的量度理论塔板数或柱效是一个数值,它表示作为保存时间函数的峰展宽的量度PW=.5PW=2柱效的计算－5σ方法用HETP表示柱效H=HETP(HeightEquivalenttoTheoreticalPlate){要求H尽可能小,这样就可以往柱子里‘装’更多的‘板’}N=#Plates(来自蒸馏理论)

5块板 10块板(较大的H)(较小的H)“较厚” “较薄”L

柱长PlateHETP分别度方程式分离因子柱效容量因子分别度方程式描述了分别度与选择性,柱效和容量因子之间的关系它是评价一张色谱图以及准备如何解决、开发和优化分别方法的依据分别度方程式假设N增加2倍或3倍，R会怎样？N对分别度〔R〕的影响分别度方程式假设k=1,2，10，20分别度分别是多少？k’对分别度的影响分别度方程式假设＝1或1.4分别度分别是多少？对分别度的影响，k’，N:如何把握分别度?原始分别状况转变k’转变转变N固定相－物理性质柱材料颗粒外形粒径VanDeemter曲线孔径柱体积柱材料不锈钢玻璃塑料HDPE(HighDensityPolyethylene)PEEK(Polyetheretherketone)色谱柱实例色谱柱构造固定相筛板色谱柱的装填筛板球形颗粒无定形颗粒填充床(固定相)填充色谱柱的流动方向规章/球形粒径/不规章粒径填充材料的外形制造颗粒技术 最新 原始的柱效 最高 良柱床稳定性 最好 好柱填充材料和类型石英〔无机〕二氧化硅与海砂相像铝〔无机〕氧化铝锆〔无机〕聚合物〔有机〕塑料杂化〔无机/有机〕碳1um=10-6m分析柱一般2.5-5um〔10um〕粒径越小，柱效越高！填料的粒径粒径分布目前常用粒径范围例如：5um(3um－7um)粒径分布范围窄，柱效高，但是本钱高3 5 7456微米HPLC常用颗粒色谱硅胶是目前为止最常用的HPLC颗粒很多公司生产很多种类的以硅胶为根底的填充才来色谱的柱效归根结底是由颗粒的生产工艺准备的颗粒的外表性质大外表积颗粒是全多孔色谱吸附剂高柱效的关键多孔颗粒〔类似于海棉里的孔〕孔的大小以原子大小为单位，Angstroms〔10-10m〕经典的分析型填料颗粒的粒径范围为60-125颗粒的多孔性－以海绵为例多孔性与大外表积的比较有很多小孔60-125高外表积300-500m2/g适用于小分子和药物的分析 很少的一些大孔250-4,000低的外表积50-150m2/g适用于大分子和蛋白的分析颗粒的外表积颗粒外表积：m2/g固体的硅胶球体5m2/g色谱硅胶300m2/g足球场=6500m2≈22g理论塔板数vs柱效每根柱子都有自己特殊的曲线，取决于不同的尺寸和粒径只有一个流速可得到最大柱效优化的范第姆特〔vanDeemter〕方程范第姆特〔vanDeemter〕方程能够推导出流淌相的线速度对给定峰的理论板高〔H〕的影响其中:A项:叫作涡流扩散项,与填料的颗粒度及其分布和填充技术相关B项:叫作轴向(纵向)扩散项,与流速有关C项:叫作传质阻力项,与填料颗粒度和流速有关HETP=HeightEquivalenttoaTheoreticalPlate)=柱长/塔板数=L/N

流淌相的线速度－u经典的定义：u0=L/L0其中：L-柱长，u0–没有保存化合物的洗脱时间被分析物谱带和vanDeemterA项XXXX谱带扩散样品分子填料溶剂XX柱内的不同流路可用来通过分子. 被分析物谱带展宽较小颗粒可以装填得更致密

削减孔隙通道间的空间

削减谱带展宽涡流集中颗粒尺寸

A项H

柱效空隙体积或通道被分析物谱带和vanDeemterB项-轴向集中BB较慢的线速度u,(或流速),更大的轴向谱带扩散=>宽峰==>更大的“B”项较高的线速度u,谱带轴向扩散的时间减少

=>较尖锐的峰==>小的“B”项uB项H

柱效（谱带扩散）被分析物谱带和vanDeemterC项传质阻力项C项由三局部奉献组成:流淌相流淌时的传质阻力

流淌相停滞时的传质阻力固定相的传质阻力〔吸附/解吸动力学〕XXX谱带展宽XXXXXX谱带展宽XX谱带展宽样品/组分带与vanDeemter方程C项-传质阻力项其中： Dm-流淌相的集中相关系数 Dsm-流淌相的停滞集中系数 Ds-固定相的集中系数 dp–粒径 df–固定相膜厚度Cm,Csm,Cs是常数H=A++CuBuu

C项H

柱效uC项

H

柱效VanDeemter曲线注：假设线速度〔流速〕超过了最正确线速度，则HETP增加，塔板数降低线速度

HETP低HETP=>优化的塔板数{mm/sec}

C项(质量传递)B项(轴向扩散)C项B项VanDeemter曲线－减小粒径粒径减小，柱效增加随着粒径减小，保持高柱效的流速范围扩大为同