植物shaserk+钾离子通道基因研究进展

植物shaserk+钾离子通道基因研究进展

k-是植物细胞中最丰富、植物生长发育所必需的阳离子。K+在酶活性的调节和膜电位的调整等一系列生理生化过程中起关键作用,也在维持植物细胞动态平衡、细胞膨压调整、调节气孔运动等生理过程中起重要作用。由于缺乏动物细胞中广泛存在的Na+/K+交换器,植物体K+吸收涉及K+通道和K+转运体两类系统。依据不同的结构和功能可将K+通道分为ShakerK+通道、KCO通道和其他通道[如环核苷酸门控通道(CNGC)]3大类。Anderson等和Sentenac等分别利用酵母的吸钾缺陷性突变体,通过互补原理从拟南芥cDNA文库中分离得到第一批植物K+通道基因KAT1和AKT1,它们的拓扑结构和功能与最初在果蝇中鉴定的ShakerK+通道相似,因此被称为ShakerK+通道基因。后来,又陆续在其他植物中发现了多种类型的ShakerK+通道基因,他们在遗传及功能上与植物的K+营养运输及植物的生长密切相关,被认为是影响植物钾营养吸收、转运和细胞钾离子动态平衡最为重要的功能蛋白。ShakerK+通道是迄今为止研究最深入的钾转运家族。本文主要介绍植物ShakerK+通道的结构、表达部位、生理功能以及调控蛋白和阳离子对它们的调节作用。1植物sh东南角Shaker家族通道是K+通道中发现最早的。Shaker一词来源于:在乙醚麻醉下缺失该基因的果蝇,自发强烈地抖动其肢体,这种表现型的果蝇取名为Shaker(颤抖)突变子。植物ShakerK+通道与动物ShakerK+通道家族在序列和结构上具有高度同源性。植物ShakerK+通道多肽拥有一个典型的很短的N端结构域,功能通道包括4个亚单位,每个亚单位拥有6个跨膜片段结构(S1~S6),且均有内部电压感受器(voltagesensor),电压感受器主要由蛋白质的S2段、S3段和S4段的氨基酸残基组成。S5和S6之间的高度保守的膜loop,称为P(pore)结构域,该结构域是陷入细胞膜内的一段多肽片段,构成通道孔。其TXXTXGYG序列是植物和动物细胞选择性K+通道的一个标记。植物Shaker钾通道蛋白的C末端位于细胞质内,是调控通道活性的重要部位。C末端胞内区有一个环核苷酸结合区(cNBD),该区与K+亚单位相互作用有关,并且在C端的最远端,形成了所谓的富含疏水性、酸性氨基酸的KHA结构域。一些植物ShakerK+通道cNBD下游还有锚蛋白区(ANKY),它有助于通道与细胞骨架的连接、蛋白质的相互作用和细胞溶质的调节。植物Shaker钾通道的拓扑结构如图1所示。Shaker通道的重要特点之一是能形成异源四聚体结构,可以使植物调节不同细胞中的K+转运活性,这种调节在每个器官或组织中是独立的,并与环境条件相关。自从采用酵母双突变体互补法从拟南芥cDNA文库中克隆到第一批K+通道基因KAT1和AKT1后,已从多种植物或同种植物的不同组织器官中分离得到多种ShakerK+通道基因。其中,拟南芥的ShakerK+家族基因是到目前为止研究得最透彻的植物K+吸收基因,该家族的K+通道蛋白有9个成员(表1)。目前已从烟草(NKC1)、水稻(QsAKT1)、玉米(ZMK1)、胡萝卜(KDC1)等其他植物中陆续克隆出Shaker通道基因。Shaker通道是选择性的K+通道,在很大程度上受电压的调控,按照受电压范围及离子流方向的不同,植物ShakerK+通道可被划分成内向整流K+通道、外向整流K+通道和弱内向整流K+通道3类。1.1植物根系k+通道基因内向整流K+通道对K+浓度敏感,依赖电压,对K+亲和力低。内向整流K+通道主要是存在于细胞的质膜上,它在细胞膜超极化的条件下被激活打开,使胞外K+流入胞内。如AKT1,AtKC1,KAT1,QsAKT1,ZMK1,KZM1等,现介绍如下:AKT1是第一个克隆到的植物内向整流K+通道基因,采用酵母双突变体互补法从拟南芥cDNA文库中筛选出来的。早期认为AKT1属于低亲和性钾通道,后认为AKT1是双亲和内流型钾通道。异源表达实验表明,AKT1只能在昆虫细胞中表达而不能在卵母细胞中表达。Northernblot分析表明,AKT1组织特异性较强,主要在植物根系中表达,尤其是在成熟根表皮、皮层和内皮层,在植物根系从土壤中吸收K+时起重要作用。用Gus报告基因发现,AKT1除了在成熟根的表层细胞中存在,在叶原基细胞和水孔中也存在。植物根系K+通道与低亲和力(0.2~15mmol/L)和高亲和力(1~200μmol/L)范围内运输K+有关。在低K+浓度范围内当细胞高度超极化时,K+的吸收也能被转运体调节。AKT1能在外部K+浓度为10μmol/L时调节植物细胞K+的吸收积累。AtKC1是Reintanz等从拟南芥中分离克隆的α亚基类K+通道基因,主要在根部表达。AtKC1作为Shaker家族,却不具有K+通道作用,但可通过调节AKT1,来中断K+流进入根毛细胞。AKT1和AtKC1都是一个异聚通道功能蛋白的组成部分。在异源表达系统中,AtKC1不能独立形成一个有功能的离子通道。然而,当AtKC1不能正常发挥功能时,根毛中AKT1介导的内向电流的生物物理特征就会发生改变。KAT1是与AKT1同时从拟南芥cDNA文库中筛选出来的植物内向整流K+通道基因。采用异源表达体系证明,KAT1能够在卵母细胞和Sf9昆虫细胞中表达,并且能够转运K+。KAT1表达具有组织特异性,主要表达部位是保卫细胞,在根和茎维管组织中也有少量表达,并与外向整流K+通道GORK调控气孔运动有关,当脱落酸处理气孔保卫细胞时,KAT1被磷酸化。KAT1对K+有高度选择性。吴平等通过米氏方程式计算其Km为35mmol/L,它不是一种高亲和K+转运系统。人们认为KAT1以低亲和力K+吸收方式进入保卫细胞,在气孔开合中扮演重要角色,并向维管组织转运K+,而不是直接从土壤中吸收K+。QsAKT1通道基因来源于水稻特化的cDNA文库。Northernblot分析表明,OsAKT1主要在根组织中表达,叶片组织上表达量较少。其表达具有明显的细胞特异性,如:在根部,它在表皮和内皮层细胞中表达强烈,而在脉管系统和外皮层细胞中表达量较少。有研究表明,OsAKT1在盐胁迫下水稻吸收K+的过程中起重要作用。ZMK1是从玉米胚芽鞘中分离的K+通道基因,主要在皮层中表达。在卵母细胞中,ZMK1通过外部酸化激活内向整流K+通道,研究表明,蓝光对ZMK1通道在玉米胚芽鞘中的分布有一定影响。KZM1是Philippar等从玉米中分离出来的1种内向整流K+离子通道,主要在玉米叶片的保卫细胞和脉管系统等部位表达。KZM1通道能调节韧皮部K+装载/卸载以及气孔开放。KZM1通道的结构、功能和表达模式与拟南芥的KAT2相似,但与KAT2相比,KZM1通道缺少细胞膜外局部分布的组氨酸,不受外部环境酸化的影响。来源于拟南芥花粉的内向整流型SPIK有助于花粉发育,在μmol/LK+浓度范围内通过负膜电位维持K+的吸收,影响花粉管的正常发育和增强花粉的竞争力。1.2透性离子检测外向整流K+通道存在于植物的各类细胞中,具有电势依赖性,可释放K+流,在细胞膜去极化的条件下被激活打开,此时的跨膜电势比较高,使K+由胞内排出到胞外。外向整流K+通道对K+有较高的选择性,其通透性远大于Na+、Li+等一价阳离子,是细胞中K+释放外流的重要途径。如GORK,SKOR等。GORK是从拟南芥保卫细胞中鉴别出的外向整流K+通道基因。GORK是保卫细胞中惟一的外向K+通道,当膜去极化时GORK被激活。有实验证实GORK在根毛细胞中也表达,作为K+感受器来发挥作用。SKOR主要在根中表达,使K+从木质部运输到芽。当K+被吸收进入根中,SKOR通过中柱使它被转移到木质部运往地上部芽,这可能是惟一对木质部汁液中钾分泌起作用的ShakerK+通道。此外,SKOR还在木质部和花粉中表达。有研究表明,SKOR与GORK能进行物理互作形成有功能的异聚外向整流通道。1.3sh-4通过k+调节nd1和akt2表达弱内向整流K+通道根据K+电化学势梯度使K+吸收或排出,如AKT2。AKT2是利用AKT1作为探针,从拟南芥cDNA文库中克隆得到的。它与AKT1、KAT1有60%同源性。它能在卵母细胞中表达并具有转运K+的作用。AKT2是至今在拟南芥中发现的惟一弱内向整流K+通道,也是ShakerK+通道家族中惟一既能介导K+内流又能调节K+外流的通道。AKT2在叶肉、叶表皮和保卫细胞以及韧皮部表达,参与通过韧皮部汁液长距离K+运输。AKT2对韧皮部K+的运输和膜电位的维持起作用,从而影响韧皮部K+装载/卸载。此外,AKT2/3与拟南芥叶肉细胞的K+渗透性和保卫细胞中钙敏感性有关。2影响转录水平的因素在转录和翻译后水平上调控ShakerK+通道活性,通道对刺激的敏感性不同。在不同环境(如光、温度和盐胁迫)和植物激素(如ABA和IAA)等因素下转录水平会发生变化。在翻译后水平上,膜极化和胞内因素(如H+、Ca2+和环核苷酸等)都能调控K+通道活性。下面主要介绍一些调控蛋白和阳离子对植物ShakerK+通道的翻译后水平的调节作用。2.1磷酸酶atpp2ca和对akt2通道活性的调节植物钾离子通道的活性受到多种蛋白的调节,如磷酯酶、蛋白激酶、G蛋白和14-3-3蛋白等。细胞质Ca2+的增加引起保卫细胞中内流K+通道的失活被特定蛋白质磷酸酶2B的抑制剂阻遏。蛋白质磷酸酶1和2A的抑制剂(okadaicacid和calyculinA),在nmol/L浓度下明显抑制蚕豆保卫细胞中内流K+通道,外流K+通道是否被影响尚未确定。叶肉细胞中内流K+通道未受影响而外流K+通道则受这两种抑制剂抑制。因此,蛋白质磷酸酶1和2A对K+通道活性的调控可能受不同细胞类型的影响。蛋白质磷酸酶2C家族(尤其是ABI1和ABI2)在脱落酸引起的气孔关闭中起重要作用,但这种磷酸酶还没有很明确的抑制剂。Chérel等利用酵母双杂交及体外结合实验证明,拟南芥磷酸酶AtPP2CA是AKT2的互作因子,且能够调节AKT2的通道活性,进而推断AtPP2CA可能是通过蛋白的磷酸化与去磷酸化作用调节AKT2通道活性。Xu等通过研究拟南芥蛋白激酶AtCIPK23及Ca2+信号感受器AtCBL1/9与AtAKT1在体内的相互作用,提出了植物响应低K+胁迫的K+吸收分子调控的理论模型。根据该模型,外界低K+胁迫信号会导致细胞内Ca2+信号的变化,这种变化由位于细胞膜上的Ca2+信号感受器AtCBL1/9所感知,AtCBL1/9通过与AtCIPK23作用,将后者带到细胞膜上。AtCIPK23通过磷酸化AtAKT1来激活该通道活性,AKT1内向K+电流得到增强,并最终提高植物在低K+条件下对K+的吸收能力。他们的研究为蛋白激酶通过磷酸化K+通道来调节通道活性提供了直接证据。研究磷酸化或去磷酸化对钾离子通道调控的过程表明ATP和非水解ATP类似物可影响钾离子通道的活性。在拟南芥叶肉细胞斑片中,ATP活化弱内向整流型K+通道的电导率,这可能与AKT2有关。在蚕豆保卫细胞中,虽然ATP对整个细胞的K+无影响,但是单通道表明内流K+被这个核苷激活。应用GTP和GDP类似物的原生质体膜片钳技术发现G蛋白对K+通道具有调节作用,该类似物与G蛋白结合形成活性GTPγS或非活性GDPβS。在蚕豆中,GTPγS能减少保卫细胞内流K+量和植物叶肉细胞外流K+量。然而,GDPβS则增加保卫细胞内流K+量和植物叶肉细胞外流K+量。木质部薄壁细胞中G蛋白激活剂增加了内流K+量。单独的保卫细胞膜片钳技术发现G蛋白作用效果也具有膜限性。研究表明钙能影响G蛋白对植物K+通道的调节作用。2.2植物外部ph值表1、2在通道孔中与Cs+的相互作用引起外部Cs+可逆阻塞是植物内向整流K+通道的典型特征。KAT1中Cs+阻塞强烈依赖于膜电位,且阻塞效率随膜电位的增加而提高。通过通道孔内的氨基酸定点突变证实了因Cs+阻塞机制和Cs+在KAT1渗透途径中的相互作用。大多数植物内向整流K+通道被毫摩尔浓度Cs+阻断,但LKT1和SKT1通道对Cs+超敏感,10~100μmol/LCs+足以抑制50%的起始流。反之,SPIK以电压依赖的方式在Cs+含量高达50~100mmol/L时受阻。内向整流型K+通道对Cs+的敏感性不同非常重要,因为Cs+在很大范围内是K+吸收的竞争性抑制剂。另一方面,拟南芥根毛原生质体的外向整流K+通道并不能被外部Cs+阻塞,原因可能是外向整流型K+通道正膜电位的产生使Cs+从通道孔排出,因而避免通道孔阻塞。细胞内外pH也影响植物ShakerK+通道活性。KAT1和KST1被胞内与胞外溶液酸化激活。KAT1内部pH感受器已在S2和S3之间环118位被确定是组氨酸残基。KST1组氨酸位于S3-S4连接区,在通道孔内作为外部pH感受器起作用,有助于通过转移活化曲线到较少的负膜电位使KST1开放,而且对单通道电导率不产生任何影响。就KAT1来说,已经表明KAT1外部pH传感器的分子基础与在KST1通道孔内确定的不同。KAT1、KST1和SIRK属于KAT1亚家族,通过胞内和胞外化合物酸化作用增加电流。与KAT1和AKT1亚家族不同,质子浓度增加抑制AKT2亚家族通道。AKT2/3、ZMK2和VFK1是被外部pH抑制,PTK2是由于胞质酸化被抑制。外向整流型SKOR通道既能被内部酸化又能被外部酸化阻塞,而GORK只被外部酸化阻塞。细胞外pH激活的通道流降低依赖于SKOR通道所激活电压的增加,而单通道电导率实际上仍不变。外向整流型K+通道的pH值的依赖性与ABA诱导的细胞酸化和SKOR上调和抑制所致的保卫细胞的胞外碱化有关。Ca2+和Ba2+等二价阳离子对植物ShakerK+通道的影响已有大量的研究。Ca2+几乎是独立地抑制ShakerK+通道,例如,Ca2+以电压依赖的方式抑制玉米叶内向整流型K+通道ZmK2.1、水稻根内向整流型K+通道OsAKT1和白杨内向整流型K+通道PTK2。Ba2+在不同程度上抑制KAT1和KAT2,KAT1对Ba2+敏感性比KAT2高。Ba2+是典型的K+通道(如烟草原生质外向整流型K+通道)抑制剂,Ba2+能抑制保卫细胞原生质K+的内流和外流以及抑制SKOR通道孔接近两个阳离子(Ca2+和Ba2+)。3sh-ras检测基因结构及功能目前已从不同植物中克隆到多个ShakerK+通道基因,尽管人们对ShakerK+通道基因的结构、生理功能和表达部位等方面有了一定程度的认识,但对于Shak