奶牛发情周期血清中卵巢卵巢发育的研究

奶牛发情周期血清中卵巢卵巢发育的研究

牛卵内外分泌激素的变化关系是育种生理领域的研究热点。boltdj等人报告了fsh、lh、质子（p4）和17雌性二醇（e2）的浓度。在奶牛发情周期中的变化规律,一致认为FSH对于原始卵泡的恢复发育有关键作用,而LH可能在卵泡的选择发育上,即卵泡优势化上起主要作用.P4和E2等卵巢类固醇激素和一些蛋白类激素能够促进卵泡的发育和分化,而雄激素、孕激素、抑制素等则起相反作用.Campbell等研究发现卵泡在发情周期中具有2~3个优势波,指出奶牛在发情周期中卵泡发育到最大体积不仅仅在排卵配种前,在此之前约发情周期的第11天左右卵泡发育也曾达到过最大体积.关于激素间协同作用,PustaD等利用发情控制和胚胎工程的研究成果对各生殖激素促进卵泡发育和排卵作了大量的报道.但有关激素对奶牛发情周期中出现的第一个最大体积卵泡作用研究报道却很少,徐直等研究指出第一个最大体积卵泡出现多在奶牛发情周期第11天左右,如果此时通过人为干扰促使卵子成熟和排卵,进而配种受胎,对缩短奶牛产犊间隔和提高繁殖力具有一定的意义.本试验研究目的是在检测黑白花奶牛在发情周期中促卵泡素、促黄体素、孕酮、雌二醇浓度和测定卵泡在发情周期中发育体积的基础上,对比分析卵泡发育和生殖激素浓度变化的关系,试图找出奶牛发情周期中第一个发育优势卵泡不排卵的原因,旨在为奶牛生殖生理研究和奶牛繁殖生产提供理论依据.1材料和方法1.1试验样本的选择2004年3月在新疆建设兵团88团奶牛场,从澳大利亚购进的100头2岁左右育成母牛中,对发情爬跨牛进行直检,触摸卵泡发育及排卵情况,以母牛接受爬跨,有成熟卵泡视为发情,统计发情周期天数,选择发情周期为21d且卵巢卵泡发育正常的育成母牛10头为试验样本.1.2卵蛋的观察和测量B-型超声波诊断仪(SSD-500日本Aloka公司生产)、探头(5.0MHz)、数码照相机(OLYMPUS).从发情第1天开始每天早晨9∶00左右扫描观察卵巢,每日1次,每头奶牛连续检测21d,每次检测时观察双侧卵巢形态,记录卵泡数量,测量卵泡直径大小,以卵泡最大垂直线的平均值为卵泡直径.1.3血清生殖激素浓度检测在2004年3月~10月期间,从试验牛发情当天开始,每天早晨9点左右颈静脉采血,采血量为10mL/次,常温自然析出血清,在4℃冰箱保存备用,每天1次,直至下次发情期前1d,即连续采血一个发情周期21d.将血样装在盛有30%的50μLEDTA的试管中,静置数小时后,以3500r/min离心15min,分离血清,收集分装后于-20℃冰箱中保存待测,30d内测定血清中生殖激素浓度.1.4标准曲线范围和灵敏度血清样品在新疆乌鲁木齐市军区总医院核医学科进行分析.血清中孕酮(P4)浓度和雌激素(E2)浓度测定,采用放射免疫量化测定法(RIA).使用的试剂盒为深圳拉尔文生物工程技术有限公司生产,名称分别是人血清孕酮放射免疫测定试剂盒(progesteroneRIAKit,生产批号0411)和人血清雌二醇放射免疫测定试剂盒(E2-RIAKit,生产批号0415),.血清孕酮P4浓度测定的标准曲线范围为0~80ng/mL,灵敏度为0.02ng/mL,激素测定的批内变异系数均小于8%,批间变异系数均小于12%;雌激素E2浓度测定的标准曲线范围为0~1000pg/mL,灵敏度为0.5pg/mL.两种激素浓度测定的批内变异系数均小于10%,批间变异系数均小于16%.血清FSH的测定采用美国农业研究中心畜牧研究所建立的抗牛FSH抗体放射性碘标记牛FSH系统的双抗体放射免疫测定法.牛血清中FSH水平的测定,按照Greenwood(1963)的氯胺-T法进行碘标记.碘标记激素、标准品(USDA-bFSH-B-I)、抗体(USDA-5-Pool-Bfsh-b).抗FSH血清最终稀释浓度为1∶60000,,第二抗体稀释度1∶3.测定灵敏度1ng/管,标准曲线剂量范围1~128ng/管.血清LH的测定采用抗羊LH抗体放射性碘标记羊LH系统的双抗体放射免疫测定法测定.氯胺-T法进行125I标记.抗LH血清最终稀释度1∶200000.第二抗体稀释度为1∶13,绘制标准曲线所用标准品是NIH-LH-S18.测定灵敏度0.1ng/管,标准曲线剂量范围0.125~16.000ng/管.整个分析过程严格按照试剂盒使用说明和实验操作规程进行.1.5统计学分析用Excel软件建立数据库,试验结果采用SPSS11.0软件统计分析程序进行统计学检验分析,计算平均数和标准差,采用F检验进行方差分析.2结果与分析2.1发情周期促黄体素浓度从图1可知,血清中促卵泡素(FSH)在奶牛发情周期中浓度变化呈现2个波峰,即在发情周期第10天-13天和第19天-20天时血清中FSH浓度最高,分别为(20.2±1.23)ng/mL和(30.2±0.46)ng/mL,只是第19天-20天的30.2ng/mL显著高于第10天的25.2ng/mL的浓度,这与焦淑贤等研究报导相似.图2也显示出促黄体素(LH)浓度变化同样呈现2个波峰,波峰分别分布在发情周期中第1、2天和第12、13天,只是第12、13天波峰相对第1到第2天要小得多.但是图3却表明血清中孕酮(P4)在发情周期中的浓度变化只表现1个波峰,尽管其随时间呈现而上下变化,但变化幅度总体只呈现1个波峰,即发情周期第19天到下一个发情周期第2天之间P4在血清中浓度明显低于其它时间的平均浓度.血清中17β雌二醇(E2)浓度变化在发情周期中第17天到下一个周期第2天一直表现较高的水平,特别在第2天达到了高峰值,值得指出的是在第9到第12天表现了一个小高峰(图4).2.2峰期各期构造如图5所示,卵泡在发情周期中明显表现出2个发育高峰,即卵泡发育在发情周期中的第10天-12天和第21天至下一个发情周期第2天两个时间段出现最大峰值,直径均达到了1.5cm,为成熟卵泡的体积直径.3讨论与总结3.1牛奶发情周期发情周期发情周期性发情期时发育的特征?据期10月第12天的情况,牛奶保图5所示,卵泡直径在奶牛发情周期中的第2天和第12天直径最大,均为1.5cm,而在第3天和第13天时直径最小,即在奶牛一个发情周期中卵泡发育有2次达到最大体积,也是排卵时的体积.但是根据试验观察记录表明,奶牛在发情第2天左右均有发情表现,而且情期配种受胎率在60%以上,而在发情周期的第12天,虽然卵泡也发育达到最大直径1.5cm,但极少有发情和排卵现象.根据约12a观察记录,奶牛在发情周期第12天左右有正常发情表现并有排卵现象的奶牛约为7‰,情期配种受胎率约35%.据BaoB等报道奶牛优势卵泡发育峰值在发情周期中有2~3个,生产实践也说明卵泡发育过程中有2次可达到排卵时体积,而且均可以排卵并配种受胎,只是为什么在情期第12天左右发情率特别低,其机理尚待探究.3.2fsh浓度与其他发育体积成正比理论从图2可知,血清FSH浓度检测表明奶牛发情周期中第10、12和20天时血清FSH浓度达到峰值,这和卵泡发育最大值相吻合.FSH浓度在第11天左右出现峰值,根据FSH浓度与卵泡发育体积成正比理论,此时卵泡发育理论上也应达到峰值,本试验研究结果也证实了这一推论.对比分析图1和图5,不难看出卵泡发育最大值总是伴随着FSH浓度曲线高峰到来而来到,二者的曲线趋于明显吻合态势.当血清中FSH浓度在高峰值的25.2~30.2ng/mL之间时,优势卵泡直径也达到最大值即0.8~1.5cm时,两条曲线的波峰和波谷基本吻合.只是第10天左右的FSH浓度显著低于第20天的浓度,但卵泡在发情周期第11天左右同样达到了成熟体积.3.3lh的浓度与排他量的关系理论上促黄体素LH对卵子具有释放作用,在生产实践上常用类促黄体素促使排卵收到了较好的效果.本研究表明LH在发情周期第2天时浓度最高,这时奶牛具有明显发情症状,可以排卵配种受胎.图2显示LH在发情周期第2天和第12天浓度出现两个峰值,但是第2天LH浓度显著高于第12天的值,这或许可以解释为什么奶牛在发情周期的第2天排卵,而第12天却很少排卵,因此认为LH浓度与卵泡是否排卵之间存在着一定的关系.3.4发情周期不同时间ph4对hc图3显示P4在发情周期第19天到下一个发情周期第2天期间浓度一直处于较低水平,这期间由于卵巢黄体被溶解后,卵泡迅速发育并分泌E2导致P4血清浓度急剧下降.但是分析图3可见,P4在发情周期第12天卵泡快速发育至成熟体积时,卵泡分泌较高浓度的雌二醇,而此时血清孕酮水平依然较高.钱云等认为这主要是黄体没有被前列腺素溶解所致.此时如果注射前列腺素溶解黄体降低P4浓度,是否可促使排卵还有待研究.据英国生物学家报道,将孕马血清促性腺激素注射到母牛体内,促进卵泡发育,然后注射克罗普溶斯坦偌尔(Clprostenol),可使卵泡破裂释放出成熟卵子,在发情周期卵子成熟期,即第11天左右进行上述处理,可以有效促使成熟卵子排出并配种怀孕,缩短奶牛发情配种周期.3.5不同浓度前列腺素对全乳手术患者全乳中其他指标的影响众所周知E2是由性腺分泌的激素,与卵泡发育程度呈正相关,本研究结果也充分地证实了这一理论的普遍性.图4分析表明奶牛在发情周期第