肿瘤微环境与多糖抗肿瘤的研究进展

肿瘤微环境与多糖抗肿瘤的研究进展

肿瘤微环境是指肿瘤生长期间的局部状态环境，由肿瘤细胞和非肿瘤细胞组成，并与肿瘤的形成和转移有关。它主要包括肿瘤细胞、内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞、细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的结构组分(如胶原蛋白、弹性蛋白等),以及其分泌的细胞因子、肽类生长因子等可溶性物质。目前,肿瘤微环境作为保护和支持肿瘤发生、发展、转移和复发的必要功能单元理论已为大部分学者所接受,越来越多的研究认为肿瘤微环境中的非肿瘤细胞及细胞外基质对肿瘤的演进有着很重要的作用。有鉴于此,针对这些不同细胞或组分为靶点开展的治疗及相关药物设计已经成为一种新的抗肿瘤策略,是对传统治疗策略的有益补充。近年来研究表明,多糖类化合物在此方面显示出了广阔的应用前景。本文对肿瘤微环境中多种生物大分子的功能进行了总结,重点阐明了天然多糖及其衍生物在调控肿瘤微环境时的作用机制及结构基础,旨在为多糖类抗肿瘤药物的开发提供新的理论参考。1肿瘤微环境1.1肿瘤微环境对不同优良因子的影响自从1971年Folkman提出肿瘤血管发生的学说以来,肿瘤血管生成的研究日益深入。目前认为,血管生成是肿瘤发展过程中的重要条件之一,肿瘤的生长、侵袭和转移与肿瘤区域的血管生成密切相关,肿瘤区域的新生毛细血管是肿瘤赖以生长和生存的物质基础,肿瘤细胞可以通过新生血管为其迅速生长提供营养物质,并排出废物。肿瘤血管生成过程主要包括内皮细胞激活、ECM降解、内皮细胞迁移、血管形成并延伸至肿瘤内部等步骤,并受到肿瘤微环境中多种促进/抑制因子的调控。表1总结了肿瘤微环境中的各种组分,如肿瘤细胞、内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞、细胞外基质等储存及分泌的促进/抑制血管生成因子。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是迄今发现最有效的一类促血管生成因子,其家族成员主要包括VEGF-A,-B,-C,-D,-E和胎盘生长因子(placentagrowthfactor,PLGF),目前研究较为清楚的是VEGF-A。VEGF-A存在3种受体VEGFR1(flt-1)、VEGFR2(KDR/flk-1)和VEGFR3,其中VEGFR1,2主要在血管内皮细胞中表达,而VEGFR3主要在淋巴管内皮细胞中表达。此外,肿瘤微环境中还存在着成纤维细胞生长因子(fibroblasticgrowthfactor,FGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derivedendothelialcellgrowthfactor,PDGF)、转化生长因子(transforminggrowthfactor,TGF)和表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)等多种能够促进肿瘤血管新生的生长因子,其各自的功能和作用机制参见表2。除了上述生长因子外,多种蛋白酶和免疫抑制因子也对肿瘤的侵袭、转移及血管生成有着至关重要的作用。1.2mmps促进肿瘤演进的机制细胞外基质(ECM)是存在于细胞与细胞之间的结缔组织,是一类由胶原蛋白、弹性蛋白、纤黏连蛋白、层黏连蛋白及蛋白聚糖等大分子物质组成的动态网状结构。其中基底膜是含有ECM成分的一个特化结构,可为正常上皮细胞黏附生长提供稳定的基质。基底膜完整性的破坏,被认为是恶性肿瘤侵袭的一个标志。ECM和基底膜的降解主要受MMPs控制。MMPs作为一组锌离子依赖性内肽酶,能够对ECM的多种组分进行水解,并受到体内天然抑制剂TIMPs及多种ECM降解片段的反馈抑制调节。MMPs在肿瘤演进中的作用在于:肿瘤细胞及肿瘤间质细胞(如肿瘤相关巨噬细胞、肥大细胞等)表面过量表达和分泌的MMPs会打破ECM的降解平衡,使肿瘤细胞能够突破基底膜和ECM构成的组织化学屏障,从而为肿瘤的侵袭与转移提供必要条件。目前研究较多的MMPs家族成员包括MMP-2和MMP-9,最近也有报道称MMP-1对肿瘤的侵袭与转移过程具有促进作用。Koshiba等曾报道胰腺癌细胞表面MMP-2的表达量明显高于正常胰腺细胞,且过表达MMP-2的肿瘤具有更强的侵袭和转移能力,也更容易造成肿瘤的复发,而MMP-2基因敲除的小鼠其肿瘤血管生成的速度则被显著抑制。类似地,在多种恶性肿瘤中pro-MMP-2及proMMP-9的表达量亦要高于良性肿瘤。一般说来,MMPs促进肿瘤演进过程的主要机制包括:①通过降解ECM,致使细胞-基质以及细胞-细胞之间的联系减少,导致肿瘤细胞和内皮细胞发生迁移。例如,MMP-2对层黏连蛋白Ln-5降解后可以使Ln-5的剪切位点暴露出来,以利于内皮细胞的迁移。②促进ECM中储存的生长因子的释放及其与生长因子受体的结合,并激活那些以酶原形式存在的生长因子及趋化因子前体,最终引起肿瘤血管生成。1.3肿瘤相关细胞和th2亚群人们很早就发现,很多肿瘤患者机体免疫系统的功能被大幅度地抑制,从而不能引起足够的免疫应答来清除肿瘤,这一现象称之为肿瘤逃逸(tumorescape)。肿瘤逃逸在肿瘤侵袭与转移的过程中是一个关键的环节,也是导致肿瘤复发和难以治愈的重要原因。近年来随着研究的进一步深入,发现肿瘤逃逸的一个重要机制为肿瘤微环境中存在着大量具有免疫抑制活性的细胞因子和生长因子,如IL-6、IL-10、IL-13、VEGF、TGF-β、M-CSF、GM-CSF等。从某种意义上来说,肿瘤微环境实质上相当于一个慢性的炎症环境,该环境浸润的免疫细胞,如淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞等不但不能发挥抗肿瘤作用,反而会沿着有利于肿瘤生长、侵袭与转移的方向分化,从而加速肿瘤演进和免疫逃逸过程。辅助性T细胞(helperTcells,Th)是机体调节免疫功能的主体,按照其分泌细胞因子种类和介导免疫功能的不同,可将其分为Th1和Th2亚型。Th1主要介导迟发型超敏反应和巨噬细胞活化等细胞免疫反应,而Th2则介导体液免疫和Ⅰ型超敏反应。Th1和Th2两个亚群的调节和平衡作用在很大程度上是由Th1型和Th2型细胞因子之间的相互作用所介导的。IFN-γ和IL-12是促进Th1分化的主要细胞因子,而IL-4和IL-10则在Th2的分化中关键作用。肿瘤微环境中存在的多种免疫抑制分子能促使Th细胞主要表现为Th2亚型,并抑制其向Th1分化,而Th2又可通过分泌IL-4、IL-10、IL-13等细胞因子进一步打破Th1/Th2间的平衡,继而影响到肿瘤浸润MΦ、DC、CTL等效应细胞或抗原递呈细胞(antigenpresentingcell,APC)的表型和功能发生改变(参见表3)。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages,TAM)是肿瘤微环境中数量最多的一类炎症细胞群,它来源于外周循环血的单核细胞,在CCL-2、CCL-5、M-CSF、VEGF等肿瘤来源的趋化因子的作用下迁移至肿瘤间质,并在IL-4、IL-10、IL-13等诱导下呈现为M2表型。TAM的浸润程度与肿瘤生长呈正相关,它递呈肿瘤抗原的能力很弱,且通过高表达IL-10而低表达IL-12介导Th2型免疫反应,并能分泌MMPs、VEGF、PDGF、TGF-β等促肿瘤生长因子,同时参与了机体适应性免疫过程。DC是生物体内目前发现的功能最强的APC,在摄取和递呈肿瘤抗原并激活CTL等效应细胞特异性杀伤肿瘤的过程中发挥着非常重要的作用。然而研究发现,肿瘤组织中的DC在多种免疫抑制因子的诱导下大多呈现出未成熟表型。例如从黑色素瘤转移生长区域分离得到的DC大多不表达或低表达共刺激分子CD80和CD86。在基底细胞癌浸润的DC中,仅有少于1%的瘤内DC以及不到10%的瘤周DC表达CD80或CD86。未成熟DC虽能够迁移至肿瘤区域并摄取抗原,但其递呈抗原给T细胞的能力被明显削弱,并有可能引起T细胞耐受。CTL是机体发挥抗肿瘤免疫过程中最主要的效应细胞,可通过穿孔素途径和死亡受体途径对靶细胞进行杀伤。与Th细胞类似,CTL也分为Tc1和Tc2两种亚群,并可通过Th1/Th2细胞因子对两者比例和功能进行调节。IL-4、IL-10等Th2型因子能够诱导CTL分化为Tc2,而Tc2又可自分泌IL-4、IL-10来促进这种分化过程。尽管Tc2仍具有杀伤活性,但由于它抑制了Th1或Tc1细胞中IL-2、IFN-γ等的合成,使CTL丧失了独立增殖的功能,杀伤作用因而也不会持久,即出现激活过程中的无反应性(activation-inducednon-responsiveness,AINR)。1.4公平工艺在糖链基因转移酶活性、蛋白区和crc1的变化肿瘤细胞表面表达的某些糖蛋白或糖脂的生物学功能近年来已逐步阐明,一般认为这些糖复合物介导了肿瘤的黏附、转移及血管新生等多种病理过程,并且使肿瘤细胞得以避免被NK细胞和CTL细胞所杀伤。在此过程中,肿瘤细胞表面蛋白异常的糖基化修饰扮演了重要角色,其很大程度上源于肿瘤细胞高尔基体中多种糖基转移酶的表达水平的变化。表4列出了肿瘤细胞表面一些异常表达的O-链聚糖,其中一个最主要的特点就是伴随着唾液酸和岩藻糖基转移酶活性的增强,O-链聚糖的末端糖链中出现了多种唾液酸化的抗原结构,而这通常被认为是肿瘤生长和转移能力增强的标志。例如在MUC1转基因小鼠的体内,发现唾液酸化O-链聚糖的含量与乳腺癌细胞的生长速率呈现正相关。另有报道证明转染了sTn合成酶ST6-GalNAc-Ⅰ的乳腺癌细胞与多种基质蛋白的黏附性降低,显示出sTn+细胞具有较强的转移能力。此外,sTn由于无法提供N-乙酰化的位点,因此只能进行O-乙酰化,这在一定程度上阻断了正常糖链核心结构Core1～4的生物合成。唾液酸化的Lewis-X抗原(sLex)是一种异常表达在肿瘤细胞表面、且与肿瘤侵袭转移过程密切相关的糖复合物,可以作为细胞黏附分子选择素(selectin)的配体。选择素根据其附属调节蛋白的不同可分为L-、E-和P-选择素,其中L-选择素由淋巴细胞分泌表达,E-选择素由活化的内皮细胞分泌表达,P-选择素由活化的内皮细胞和血小板共同分泌表达。sLex与E-选择素结合后可以帮助肿瘤细胞穿过血管或淋巴管的基底膜,进入血液和淋巴循环,实现其在器官间的转移,而L-选择素和P-选择素能够使肿瘤细胞与淋巴细胞及血小板发生黏附,从而使肿瘤逃脱免疫细胞的进攻。1.5hspg的功能硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparansulfateproteoglycan,HSPG)是存在于肿瘤细胞、内皮细胞表面及ECM中的一类糖蛋白,其结构由一个核心蛋白和若干个硫酸乙酰肝素(heparansulfate,HS)链通过O-连接构成,其中HS链可以结合ECM中的多种生长因子、趋化因子或蛋白酶,并对其基因转录及活性进行严格调控,因而HSPG表达的改变会直接影响到ECM与基底膜屏障的结构和功能,以及肿瘤细胞浸润、迁徙和增殖的能力。关于HSPG对肿瘤演进过程是存在促进作用或抑制作用,目前还存在争议,但近年来更多的研究结论倾向于前者。例如有人检测到胆管上皮癌和肝癌基膜中HSPG核心蛋白mRNA的表达水平明显上调,并且与血管生成呈正相关。在某些癌症患者体内也观察到ECM及循环系统中聚集有大量的HSPG,其与趋化因子结合后能促使趋化因子形成梯度分布,从而有利于肿瘤细胞的血管或淋巴管转移。HS链在体内能够被类肝素酶(heparanase)水解成由10～15个糖单元组成的片段,一方面这能够使ECM的完整性被破坏,有利于肿瘤细胞的转移,另一方面ECM降解后会释放出多种储存在内的血管生长因子,如FGF、HGF、PDGF、VEGF、EGLGF、PIGF-2、TGF-β1、HIP等,由于其结构中均具有HS结合区域,能够和HS链片段结合,从而促进生长因子在局部的富集及激活,并通过多变的HS链使生长因子免受各种理化因素的影响降解,以及通过形成HS-生长因子-生长因子受体三元复合物增强生长因子的信号传导。有报道称,类肝素酶能够通过促进p38的磷酸化而上调内皮细胞中VEGFmRNA的表达,并激活Akt途径介导的内皮细胞转移。此外,向人乳腺癌细胞、小鼠淋巴瘤或小鼠黑素瘤中转染入针对类肝素酶基因hpa设计的核酶或siRNA后,能显著降低其转移及血管生成的速度。2多诺塔对肿瘤微环境的调节机制2.1alyl2-3肿瘤细胞表面sLex的合成以及其与选择素间的结合是实现肿瘤在器官间特异性转移的关键步骤。因此,干扰两者之间的识别与结合过程为抑制肿瘤的转移和扩散提供了一个良好的作用靶点。目前,针对该靶点的多糖药物主要具有两方面作用:①作为肿瘤细胞表面异常表达多糖的结构类似物,竞争性与选择素结合,从而破坏肿瘤与内皮细胞、淋巴细胞及血小板的黏附。Kawamura等发现Sda是一种仅表达于正常胃肠黏膜的与sLex结构类似的糖复合物,其糖链结构为GalNAcβ1-4(sialylα2-3)Galβ1-4GlcNAc,将其合成酶β1-4GalNAcT基因引入胃癌细胞KATOⅢ或结肠癌细胞HT-29后,可以上调肿瘤细胞表面Sda的表达水平,从而竞争性抑制sLex与选择素之间的黏附,对肿瘤的侵袭与转移具有一定的抑制作用。Zeisig等合成了一种sLex的糖脂衍生物(sLex-PEG-liposomeE),发现它对肿瘤细胞与固定化E-选择素、E-选择素基因转染细胞以及HUVEC三者的黏附能力均有明显的抑制作用。②作为唾液酸转移酶或岩藻糖基转移酶的底物类似物,竞争性抑制糖基转移酶的活性,降低肿瘤细胞表面异常的糖基化修饰。有文献报道了乙酰化二糖及其衍生物可作为Lewis型抗原合成的寡糖底物,竞争性抑制内源性糖蛋白的末端糖基化,降低sLex在肿瘤细胞表面的表达。例如全乙酰化二糖(Ac)6GlcNAcβ1,3Galβ-O-萘甲醇(AcGnG-NM)可以抑制LS180细胞表面sLex的合成;并且通过形成sLex类似物,干扰sLex与E-或P-选择素之间的识别与结合过程,从而阻断LS180对活化内皮细胞和血小板的黏附。目前一些天然多糖在此方面也显示出了良好的应用前景。从姬松茸(AgaricusblazeiMurill)中提取得到的一种小分子多糖LMW-ABP能下调HT-29细胞中岩藻糖基转移酶FucT-Ⅶ和sLex的转录和翻译水平,并抑制sLex与内皮细胞HUVEC的黏附。来源于海参的一种岩藻糖硫酸软骨素(FucCS)也具有抑制LS180表面sLex与P-和L-选择素结合的能力,并可阻碍小鼠体内结肠癌细胞向肺部的转移。2.2岩藻聚糖硫酸酯化纤维素MMPs在肿瘤细胞侵袭转移过程中的作用长期以来一直受到人们的关注,目前针对MMPs抑制作用筛选得到的一些天然大分子多糖由于其安全可靠、来源广泛等优点,有望替代传统的小分子化学抑制剂。研究发现,岩藻糖以及富含岩藻糖的多糖可抑制内肽酶的生物合成及酶原激活,从而下调MMP-2和MMP-9的活性。对岩藻聚糖硫酸酯(fucoidan)的功能进行研究后也发现其能抑制MMP-2和proMMP-3的分泌,并促进MMP-TIMP复合物的形成。Belsley等报道了一种商品化的硫酸酯化海参多糖(商品名:InflaMastat)能够通过抑制MMP-2的活性来有效延缓腹部大动脉动脉瘤的扩张,体外实验表明其浓度在100μg/mL时抑制率可达80%。Wang等发现,来源于曼氏无针乌贼(Sepiellamaindroni)墨汁的硫酸酯化多糖SIP-SⅡ能明显降低SKOV3中MMP-2的活性。WesternBlot分析发现SIP-SⅡ能够抑制SKOV3和ECV304中proMMP-2与MMP-2的表达,并阻断ECV304的转移以及SKOV3对基底膜的穿透作用。最近,一种从壳寡聚糖混合物中分离得到的二乙酰化六聚糖也被证明对绒毛尿囊膜的血管生成、以及MCF-7诱导的ECV304的增殖和转移具有明显的抑制作用,其分子机制为上调了ECV304中TIMP-1mRNA的表达水平。2.3天然多糖抑制ecm的活性HSPG和类肝素酶在促进肿瘤演进的过程中扮演着重要的角色,而针对此靶点设计开发的HSPG结构类似物由于能作为类肝素酶的竞争性底物,抑制其活性并干扰HS链与生长因子或趋化因子的结合过程,已成为抗肿瘤药物研发的一个新策略。目前通过多种修饰手段,如选择性去硫酸化、N-乙酰化和乙二醇拼接等已获得了多种能够抑制类肝素酶功能的HS衍生物。例如2-O-或3-O-去硫酸化的HS(2/3ODS-HS)能够阻断肿瘤细胞表面内源性HSPG与P-选择素的结合,从而抑制肿瘤细胞转移。HS经N-乙酰化后通过乙二醇连接形成的衍生物(100NA.RO.H)对类肝素酶的抑制作用明显增强,同时能降低bFGF与肿瘤细胞的结合及促增殖能力。研究还发现,100NA.RO.H对储存在ECM中的促血管生成因子结合能力较弱,因此能够避免不必要的ECM的激活及降解,显示出了较高的特异性。近几年来,一些天然多糖也显示出了较强的抑制肿瘤血管生成的作用。构效关系研究表明,这些多糖大多含有SO42-基团以及与HS类似的结构单元。如Bix等报道一种表达于串珠素C端的蛋白聚糖Endorepellin,其糖链部分为HS,它可以与小鼠原位鳞状移植瘤和同源Lewis肺癌的内皮细胞相互作用,干扰肿瘤毛细血管的形态学特征。Koyanagi等发现过硫酸酯化岩藻糖OSF对荷瘤小鼠体内S180、B16以及Lewis肺癌细胞中血管生成具有明显的抑制作用,并能通过阻断VEGF165与细胞表面受体的结合来降低HUVEC的有丝分裂能力和趋化性,且OSF的血管生成抑制作用要强于中性岩藻糖NF,提示该活性可能取决于糖链中硫酸基团的数量。Dias等亦发现来源于褐藻(Sargassumstenophyllum)的多糖Sarg具有与HS类似的聚阴离子结构,它能够部分抑制bFGF介导的血管生成。此外,有文献报道了一种有别于上述硫酸化多糖主链结构的葡聚糖分子CMDB,发现其也具有抑制肿瘤生长及肿瘤区域微血管形成的活性,并且由于结构中不含硫酸化基团,因此不会引起抗凝血等不良反应。对CMDB进行化学修饰,引入苯酯基团后形成的新分子NaPaC(图1),其抑制肿瘤血管生成的能力较CMDB又提高了10～100倍。NaPaC能够完全抑制HS链与VEGF165的结合,以及阻碍VEGF165与其高亲和受体VEGFR2、NRP-1间的相互作用。尽管在这一点上NaPaC与硫酸化多糖极为相似,但有文献认为它们影响生长因子中HS结合域的方式并不完全相同。硫酸化多糖主要通过SO42-基团的静电作用以及与蛋白分子中羟基和羰基形成氢键的方式与生长因子的HS结合域结合;而CMDB和NaPaC主要是通过其苯环结构与生长因子蛋白中的芳香基团形成π-π键而结合。这些芳香基团一般靠近HS结合域,带有苯环的多糖与这些残基结合后能发挥位阻效应阻碍HS链与生长因子的结合。在CMDB的苯环上接入能够破坏π-π相互作用的位阻基团-SO3后,会减弱其对生长因子的抑制作用。2.4多糖代谢agritchal微环境长期以来,人们一直认为机体的免疫系统在肿瘤演进的过程中能够起到清除肿瘤、保护自身的作用,但随着近年来研究的逐步加深,已有越来越多的证据证明肿瘤浸润的免疫细胞不但不能发挥抗肿瘤作用,相反却能促进肿瘤的生长、侵袭与转移,这主要是由于肿瘤细胞能够分泌多种免疫抑制因子及趋化因子,使得免疫细胞被“驯化”成为肿瘤演进与免疫逃逸过程中的“帮凶”。有鉴于此,一种相应的抗肿瘤治疗思路——寻找合适的免疫调节剂,逆转肿瘤微环境对免疫细胞的“驯化”作用,使机体恢复正常的免疫功能——也就应运而生。多糖所具有的免疫调节活性近年来已为人们所普遍接受,大量研究证实来源于不同植物、动物和微生物的多种天然多糖组分多能通过提高机体免疫力而实现抗肿瘤作用。例如本实验室从海洋真菌(Phomaherbarum)菌丝体中分离得到的一种全新多糖YCP具有显著的免疫增强能力,包括刺激淋巴细胞增殖、促进T细胞和巨噬细胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α、NO等多种细胞因子,以及提高体内NK和CTL细胞的杀伤能力等。Han等报道了来源于刺五加(Acanthopanaxsenticosus)的多糖组分ASP能够激活B细胞增殖并分泌IgM,以及上调巨噬细胞中IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表达。另有研究表明某些天然多糖还具有激活补体的作用,例如从心叶青牛胆(Tinosporacordifolia)中提取的多糖可使血中C3a成分逐渐增高,证明其能激活人血清补体的替代途径。天然多糖所呈现出的上述活性使得其在逆转肿瘤微环境的免疫抑制方面显示出了较大的开发潜力,通过近几年的研究,已取得了一些可喜的进展。Th1/Th2型应答对机体免疫激活/抑制的调节有着非常重要的作用,在肿瘤微环境中Th1降低而Th2增强,从而引起多种免疫细胞功能的减弱,包括未成熟DC含量的增加、TAM向M2型分化、以及CTL杀伤能力的下降等,最终导致肿瘤演进与免疫逃逸。目前临床上调控Th1/Th2漂移的方法主要包括:①采用IL-12、IFN-γ等Th1型细胞因子;②使用Th2型细胞因子抗体IL-4McAb或IL-10McAb,阻断Th2型细胞因子的免疫抑制作用。但上述方法存在着不良反应较大、作用时间较短、价格较高等局限性,从而限制了其应用,并促使研究者们将目光转向了安全低毒的天然大分子多糖类化合物。Pinto等发现从姬松茸(Agaricusbrasiliensis)中提取得到的多糖组分能够促进荷瘤小鼠脾细胞分泌IFN-γ,并抑制IL-10的合成。Yang等也报道了当归多糖(Angelicasinensispolysaccharides,AP)能够促进正常小鼠脾细胞分泌Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2,而抑制Th2型细胞因子IL-4的分泌。来源于胡黄连(Picrorhizascrophulariiflora)的多糖CG与淋巴细胞作用后也检测到了类似的结果,即明显促进IL-2、IL-12和IFN-γ的分泌,以及抑制IL-4和IL-10的分泌。IL-12除了能激活Th1应答外,有文献表明其对VEGF、bFGF等生长因子及MMPs的