啤酒酵母絮凝机理的假说

啤酒酵母絮凝机理的假说

啤酒母亲的凝缩性在啤酒生产中起着特殊的作用。凝缩性差异影响着发酵速度和发酵程度，阻碍了啤酒过滤方法的选择，阻碍了多重发酵，并影响了啤酒的味道。自19世纪70年代法国人LouisPasteur首先在酵母体系中发现了絮凝现象,迄今已经130多年,在此期间诸多专家学者致力于酵母絮凝机理的研究,尤其是20世纪50年代以来,通过从遗传学及分子生物学方面去揭示絮凝机理,取得了很大的突破。本文拟就啤酒酵母絮凝机理研究方面进行简要综述。1葡萄酒和发酵母的凝缩机制的假设1.1酵母细胞絮凝机理早期的有关研究者根据各自对酵母絮凝现象的观察与研究,相继提出了一些试图解释絮凝机理的假说,有“絮凝共生假说”、“蛋白质沉淀假说”、“絮凝胶体假说”、“钙桥假说”等,他们试图从酵母污染、培养基内蛋白依附酵母细胞壁、胶体理论、钙离子作用等方面来解释酵母细胞的絮凝机理。如Mill提出酵母絮凝的产生是由于细胞壁表面多糖的氢与羟基之间的氢键作用和阴离子基团间以Ca2+为盐桥的联结作用。这些假说考虑的层面过于简单且各有缺陷,随着对絮凝机理研究的不断深入,目前已经很少有人支持。1.2钙离子桥连接其他细胞的-甘露聚糖位点Miki指出,絮凝的产生是源于絮凝性酵母细胞表面的识别因子通过钙离子桥连接其他细胞的α-甘露聚糖位点,该识别因子是类似外源凝集素活性的蛋白质,由专一的显性基因FLO1编码控制。因为,α-甘露聚糖、FL01编码蛋白和Ca2+是酵母絮凝所必需的,见图1。1.3图像絮凝活性Teunissen提出:酵母细胞壁上的特定表面蛋白(絮凝素)直接与相邻酵母细胞壁上的甘露糖残基之间的专一性结合引起絮凝,钙离子起到助凝剂的作用,促使絮凝素与甘露糖残基的特异结合。由于絮凝性酵母和非絮凝性酵母的细胞壁表面都存在甘露糖残基,因此能否发生絮凝的主要因素就在于是否有絮凝素存在。Straver等人首次从啤酒酵母细胞壁分离到酵母细胞絮凝活性的絮凝素,将分离到的絮凝素加入到絮凝酵母细胞后明显增强细胞的絮凝能力,加入到非絮凝酵母细胞后能使细胞呈弱絮凝能力。在Nishihara等人进行的非絮凝酵母和絮凝性酵母的共絮凝研究也证实并支持了絮凝素假说。絮凝素假说模型如图2所示。2lo1型表型在加入甘露糖的培养基中,絮凝作用被抑制,是由于自由的甘露糖占据了特定表面蛋白的结合位点,使之无法完成与细胞表面甘露糖残基的结合,这种现象称为酵母絮凝的糖抑制。根据啤酒酵母细胞的糖抑制图谱,可以分为两种表型:FLO1型和NewFLO型。FLO1型只被甘露糖抑制,而不被葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和半乳糖抑制;NewFLO型可以被甘露糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖抑制,而不被半乳糖抑制。这两种有明显区别的表型分别由FLO1基因和Lg-FLO1基因控制,两种基因在196号、240号氨基酸上的差异决定了两种表型的差别。目前,我国啤酒生产中使用的下面发酵啤酒酵母大多属于NewFLO型,而上面发酵啤酒酵母多属于FLO1型。有研究者通过对比两种表型的酵母的生理生化特性,提出两种絮凝型酵母的絮凝机理可能分别属上述两种絮凝假说之一。但除了以上两种常见表型之外,近来又有研究者发现存在对甘露糖不敏感的个别酵母菌株,它们的絮凝作用机理无法用类外源凝集素和絮凝素假说来解释。Straver等人的研究指出,在某些情况下,絮凝不仅仅依赖于絮凝素,而且需要凝集素和类纤维结构的存在。3酵母絮凝的发现1951年,在Brighton举行的欧洲酿造会议上提出酵母絮凝是一种可遗传的特性,开启了从遗传角度出发去研究絮凝机理的新潮,到目前为止已经发现了近40个与酵母絮凝有关的基因,见表1。3.1flo1基因序列及特点编码絮凝蛋白的基因称为FLO基因,发现最早、研究最为广泛的絮凝基因是FLO1,其他重要的FLO基因还有FLO2,FLO4,FLO5,FLO3,FLO6,FLO7,FLO9,FLO11,Lg-FLO1等,把它们统称为FLO基因家族。Rusell研究证明FLO1,FLO2和FLO4是等位基因。Wateri等人对FLO1基因进行了克隆和序列分析,研究表明,完整的FLO1基因位于Ⅰ号染色体的右臂上,编码1537个氨基酸的4611bp组成了FLO1基因的开放阅读框架,FLO1蛋白的显著特征是含有4种重复序列和大量的丝氨酸和苏氨酸,FLO1蛋白C-末端和N-末端区域均呈疏水性。Bidard等进行了FLO5基因的克隆和分析,证明FLO5基因是显性基因,可以通过热处理或蛋白酶处理等生理生化实验分析区别FLO5和FLO1基因控制的絮凝表型。显性基因FLO9与arg4呈松散连接,受交配型的影响,FLO11表达也受到交配型的控制。Lg-FLO1基因编码的絮凝蛋白可以同甘露糖和葡萄糖结合,表现为NewFLO絮凝表型。通过不同絮凝基因的克隆、序列分析和表达,为研究絮凝机理提供了有力的手段和方法。3.2flo基因家族在菌株间的作用Stratford指出,当FLO基因启动后,絮凝蛋白产生,絮凝现象也就随之而产生。但他的论点很快被否定。相反,某些能激发FLO基因的因素有可能会阻碍絮凝的发生,仅从FLO基因家族来看,絮凝现象的背后有着错综复杂的原因:首先,FLO基因家族是相当不稳定的,在不同的菌株种系甚至是同一菌株的不同的代数中,FLO基因可能存在很大的差异;其次,FLO基因家族包含多种不同的FLO基因,它们中的每一个基因可能分别由不同的复4机制所调控,可以由不同的因素诱导或阻遏。Kobayashi对FLO8进行了克隆测序,结果表明FLO8并非絮凝结构基因,而是起到FLO1和FLO9基因转录激活子的作用。除FLO基因引起的絮凝之外,还发现一些突变也会引起絮凝,其表型与FLO1型相似,如CYC8和TUP1突变型。对TUP1和CYC8的克隆和测序结果表明,除TUP1与编码G蛋白β-亚基同源外,未发现与其他蛋白同源,这意味着TUP1和CYC8具调节特性,其产物可能是多效调节因子,与絮凝激活子和结构基因相互作用。此外,细胞壁基因abs,wal突变也会引起絮凝,线粒体基因组中的olie和oxi2的缺失导致菌株絮凝能力的丧失。在表1中列出了已经发现的FLO基因的调节基因及线粒体基因和异源基因。4葡萄糖母凝胶物的改进和应用4.1啤酒絮凝性差在啤酒酿造过程中,不仅要求酵母快速发酵麦汁,而且要求酵母在发酵结束时形成稠密的沉淀。絮凝性差的酵母能实现快速发酵,但发酵液澄清缓慢,造成过滤困难;相反,那些絮凝能力太强的菌株则通常会从发酵液中过早的絮凝而分离出来,导致后发酵不完全,造成啤酒口味不佳且生物稳定性较差。所以,一直以来对啤酒酵母絮凝性状的选择成为酿造师必须要考虑的因素。4.1.1外添加酵母絮凝剂虽然可以通过基因改良的方式提高酵母的絮凝能力,但酵母絮凝性提高会影响啤酒的发酵度,不利于生产淡爽型啤酒。在酵母絮凝性改良受到发酵度制约的情况下,可以采用外添加酵母絮凝剂,诱导酵母非自发絮凝,在发酵终了时使酵母迅速凝聚沉淀下来。笔者认为可以考虑的途径有3点:①使用传统的啤酒絮凝澄清剂,如鱼胶等;②利用啤酒酵母与其他微生物的吸附作用,筛选出可絮凝啤酒酵母的新型微生物絮凝剂;③利用基因工程手段,获得大量絮凝蛋白,向发酵液加入絮凝蛋白以调控酵母絮凝程度。4.1.2酵母絮凝活性研究目前,已完成对FLO1基因的克隆和序列分析并用以转化上面和下面发酵酵母,所得转化子的絮凝性都比它们的母株强。Watari等人FLO5菌株与工业菌株杂交或原生质体融合,得到絮凝性较强的酵母。郭文洁等进行了絮凝基因在啤酒酵母菌株中的表达研究。但目前FLO基因修饰酵母应用于啤酒工业中所面临的最大问题依然突出,即酵母在发酵后期细胞数太少,导致发酵速率急剧下降,后发酵不完全。如果能找到一种方法控制FLO基因只在发酵达到一定程度后方可高效表达,那么将对啤酒生产领域产生深远的影响。4.2母因子方案在其他方面的应用4.2.1生物营养的应用酵母表达载体一般以药物抗性或营养缺陷型作为选择标记,但抗药性基因的引入可能会出现食品安全等问题,而大多数工业菌株是营养型,为获得营养缺陷型进行诱变容易使原有性状发生改变。利用絮凝性使细胞分离的特性,可用作选择性标记,构建絮凝选择载体,减少食品安全隐患。刘小琳等以絮凝基因FL01为选择性标记构建酵母表达载体,利用该载体克隆并表达了β-葡萄糖苷酶基因。4.2.2酵母细胞表层展示和定向进化絮凝素蛋白具有糖基磷酸肌醇(GPI)锚定点,利用絮凝素Flolp的C末端的膜锚定功能区和N末端絮凝功能区可构建成两个酵母细胞表层展示体系,有望实现多种酶和功能蛋白的展示和定向进化。Matsumoto利用絮凝蛋白与脂肪酶N末端的连接成功将高活性脂肪酶展示在酵母细胞表面。4.2.3酵母絮凝性状的控制利用酵母絮凝蛋白与细菌