酒曲的研究进展

酒曲的研究进展

酒曲是通过在制备的谷物及其添加剂上接种或使用天然细菌（细菌、发酵母菌、细菌）制备的。酒曲是中国酒酿造的糖化、发酵和生香剂,含多种微生物及其产生的酶,其品质对酒的产率和品质影响极大,故有“曲是酒之骨”之称。中国是世界三大酿制酒发源地之一,酒曲发酵酿酒是中国酿酒的精华所在。根据风味,中国白酒被分为多种风格,如酱香型、浓香型和清香型等。纵观世界酿酒史,特别是谷物原料酿酒技术,主要有2大类,一类利用谷物发芽产生的酶将原料糖化;另一类是用发霉的谷物制成酒曲,用酒曲中所含的酶将原料糖化。酒曲生产技术在北魏的《齐民要术》中第一次得到全面总结,在宋代已达到极高的水平,酒曲品种齐全,工艺技术完善,尤其是南方的小曲糖化发酵力很高。商业酿酒者经常根据当地特色原料和喜好生产酒曲。因此,酒曲因地域、各家经验而复杂混乱,酒曲质量不稳定,造成酒质量波动显著,口味各异。另外,酒曲生产没有统一标准,没有健全的品质检验标准等也是导致行业发展缓慢的原因。本文讨论了酒曲的原料、功效、制备、检测方法等方面,为酒曲的进一步研究开发、标准制定等提供参考。1小程序水曲工艺酒曲原料主要是小麦、大米、大麦、豌豆、高粱等谷物,中药材及特色植物为辅助。中国白酒因其不同风味而大受欢迎,这些风味是因采用的酒曲不同而造成的。如汾酒大曲是清香型大曲,它是利用大麦和豌豆制作而成。张大为等以糯米为基料,甘草、肉桂、陈皮、辣廖草、曲母为辅料制作酒曲。缪晓平等以糯米和小麦为主要原料研制中药甜酒酒曲,各成分对药酒曲品质的影响依次为甜酒曲>甘草>肉桂>八角茴香;药酒曲的最佳配比为总重量50g的糯米与小麦4∶1混合、甜酒曲0.20g、肉桂0.015g、甘草0.70g、八角茴香0.03g。越南传统酒曲因制造者不同,辅料的种类和数量也不同。然而,最常见的辅料主要是肉豆蔻皮、甘草根、细辛、白豆蔻果、茴香和丁香。茴香和丁香可加强香气,抑制有害微生物的生长。2影响大曲微生物的因素酒曲发酵而成大约需1个月,其制作过程已部分工业化,但主要程序仍保持传统工艺。传统大曲制作工艺如图1。Wang等对茅台酒大曲制作工艺及其特性形成因素进行了研究,大曲制作过程包括原料混合及定型,发酵、成熟与干燥3个阶段。蒸煮过的谷物、辅料等混合物在一定温度下发酵21~28d,6个月的成熟期,成熟阶段是微生物生长和风味物质生成的最重要时期。大曲主要包括2大部分:原料和多种微生物菌落。大曲特性形成需要复杂微生物菌群,包括真菌(霉菌和酵母菌)和细菌。许多内源和外源因素能影响大曲微生物菌落的富集和构成,如原料品种、湿度、温度等。微生态环境也可能影响大曲中微生物的变化,其被很多因素限制,如地区、天气、水、土壤等。大曲制作过程中微生态环境使茅台酒极其特殊,以致其他地方无法模仿。目前,随着工艺技术的提升,制作工艺对酒曲特性影响以及功能性酒曲开发有了显著提高。吴岱熹研制富含γ-氨基丁酸的清酒酒曲,将大米浸泡在含有7.5mg/mLVC和2.0mg/mLL-谷氨酸钠水溶液中过夜蒸熟;然后接种米曲霉3.800;采用变温培养,即30℃20h、32℃4h、35℃14h、38℃8h。以此得到的酒曲中γ-氨基丁酸含量6.936mg/g,清酒中含量0.439mg/mL。Yoshizaki等分析了原料和温度对红曲中葡萄糖糖化酶和α-淀粉酶的影响。结果表明,大麦最适合菌丝生长。在25℃和40℃下可增加酶产量。在红曲制作后期48h中,温度从35℃降到25℃,能增加葡萄糖糖化酶和α-淀粉酶产量(分别为25℃时产量的1.4倍和18倍)。淀粉酶和蛋白酶是重要的水解酶,主要用于分解淀粉和蛋白。一个制作精良且贮藏良好的种曲应具有高水解酶活性。酒曲发酵原料和工艺能影响水解酶产量和活性以及产品的风味。Bechman等发现,发酵时间和贮藏温度能显著影响清酒曲的α-淀粉酶和蛋白酶酶活性、湿度、pH。在对数生长期,随着米曲霉数量的增加,曲中α-淀粉酶活性增加。大麦曲中酶活性显著高于大米曲,在发酵46h和58h,酶活性分别达到211.87U和116.57U。当菌种进入稳定生长期后,酶活性都相应降低。在发酵和贮藏过程中,曲中蛋白酶活性相对较低。3葡萄酒中细菌、真菌和酵母菌群落组成微生物是决定酒曲品质的核心因素,其随酒曲种类、产地、部位和工艺的不同而存在差异。在传统酒曲中存在霉菌、酵母菌和细菌3个主要微生物群。普遍认为,霉菌主要产生淀粉酶,降解淀粉变成可发酵的糖类;酵母菌把糖转化为酒精;细菌主要是乳酸菌,是最有可能的污染菌。酒曲制作中,发酵初期霉菌繁殖旺盛,谷物表面长满菌丝;随着发酵的进行,霉菌分解淀粉产生大量糖,为酵母菌的繁殖作好了准备;随后乙醇不断积累,破坏了霉菌的生长环境,霉菌减少,酵母菌占优势。Wang等对茅台酒曲中200多个菌落进行定性分析,显示存在细菌、霉菌和酵母菌。细菌由杆状菌芽孢杆菌为主、乳酸杆菌及醋菌属和梭菌属的细菌组成;霉菌由曲霉属、白霉属、根霉属、红曲霉和木霉属的霉菌组成,曲霉菌最常见;酵母由酵母属、汉森酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属和孢圆酵母属的酵母组成,最常见的为酵母属。越南湄公河地区的紫糯米酒是用传统固体酒曲生产而成。Dung等研究了29个越南商业酒曲的特性,筛选出6个酒曲,其中总的霉菌、酵母菌和细菌数分别为3.4~6.0logCFU/g、5.8~7.2logCFU/g和2.6~6.2logCFU/g干重。由119株菌株(53株霉菌、51株酵母菌和15株细菌)组成。活性强的霉菌为淀粉丝菌、非典型淀粉丝菌、少孢根霉和米根霉。淀粉丝菌能产生达25%的葡萄糖,淀粉葡萄糖苷酶活性达0.6U/g。酵母菌中5株为酿酒酵母,它们能使浓度为20%的葡萄糖生成8.8%的酒精,批次发酵中可达13.4%。Fujita等得到植酸酶高产量的米曲霉突变株,突变株产生的植酸酶及相关酶可从大米植酸中释放无机磷酸盐,影响酵母生长。利用这种突变株生产清酒酒曲,可提升醪液中酵母的生长,并且在不影响清酒质量的情况下增加酒精产量。对菌种研究较多的为霉菌和酵母菌,对乳酸菌的研究很少。但乳酸菌在发酵过程中起着很重要的作用。米酒中细菌以乳酸菌为主,其产生的乳酸是米酒酸味的主要来源。乳酸与乙醇反应生成酯类是米酒重要的风味物质,同时乳酸菌代谢过程中产生乙醛和双乙酰,赋予米酒特殊的风味。米酒中乳酸菌可直接应用到实际生产中,有些研究者直接将米酒作为发酵剂,开发出不同口味的米酒乳饮料。4抗氧化性化合物酒曲是一种混合微生物发酵剂,它带给酒的不仅是酸甜口感、清爽酒香,更宝贵的是其在发酵过程中的代谢产物有多种卓越的医疗辅助作用。早在李时珍的《本草纲目》中就记载了用于酿制小曲白酒的曲药有药用功效,常用其治消化不良,根霉酒曲能“消食活血、健脾开胃”。近年来,出于健康安全的考虑,天然抗氧化剂成为趋势。对于天然抗氧化剂的生产,微生物展现出巨大潜力。白曲霉(Aspergilluscandidus)CCRC31543发酵液的乙酸乙酯提取物(EAEAC)表现出显著的抗氧化性。EAEAC中的抗氧化成分被确定为3,300-dihydroxyterphenyllin、3-hydroxyterphenyllin和candidusinB。这些化合物既不会对人体肠道细胞407产生细胞或基因毒性,也不会对沙门氏菌TA98和TA100产生突变。曲霉产生的物质如阿魏酸及其衍生物,具有抗癌、抗菌、抗氧化性及血压调控等功效。红曲霉产生多种功效成分,包括红色素、γ-氨基丁酸和莫纳可林K,被应用于着色剂、医药和保健业。Taniguchi等利用乳酸菌素成功抑制了米酒中火落菌(一种使米酒产生饭腐臭的菌群)的生长,而酒曲中某些菌种能够产生乳酸菌素,这为通过不同菌群组合产生更多功能甜酒曲的制造提供了可能。在清酒发酵中,酒曲分泌α-葡萄糖苷酶,催化形成乙基-葡萄糖苷酶,具有护肝和加强角质形成细胞的分化功效。在豆酱发酵过程中,大豆和小麦的过敏原一部分被种曲蛋白水解酶降解,因此豆酱不能诱导大豆有关的过敏反应。酱油和豆酱的棕色来源于类黑精,它是由还原糖和氨基酸的美拉德反应形成的。类黑精不仅对于食品风味和色泽具有重要作用,而且促进微生物生长,抑制癌细胞生长,抑制消化酶和抑制抗突变性。种曲可作为一种功能性食品或作为其他功能性食品的成分。5其他基因型微生物目前对酒曲研究已经进入分子领域,基因组学、蛋白质组学逐渐成为研究焦点。传统微生物定性定量方法有效但耗时费力;分子学方法为微生物分析提供一个新思路。Shi等利用传统和分子学方法对汾酒曲微生物进行分析,他利用平板法对微生物计数,利用细菌的16SrDNA和真菌的内含间隔区转录进行定性,细菌、乳杆菌和放线菌仅在酒曲表面检测到,芽孢杆菌是主要菌群。复膜孢酵母和伊萨酵母分别是表面和内部的主要菌种;此外,在内部发现了嗜热真菌。印度研究者利用引物(ITS1-5.8S-ITS2)进行PCR扩增得到5.8SrRNA基因序列,然后对其转录内含间隔区(即真核生物的内含子)进行限制性酶切分析,通过同源比对得到Hamei中酵母菌株分子鉴定结果,得出9种类型酵母,其中最常见的为酿酒酵母(32.5%)、毕赤酵母(41.7%)和Trichosporonsp.(8%)。Lv等利用巢式PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)对2个发酵剂(红曲和药曲)中微生物(真菌和细菌)进行研究。细菌PCR-DGGE图谱表明,细菌主要是芽孢杆菌,包括人参土芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草杆菌、甲基营养型芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。在酒曲中检测到乳酸菌包括肠膜/赫伦明串珠菌、戊糖片球菌和乳酸片球菌。真菌PCR-DGGE图谱表明,药曲中稻根霉菌、小孢根霉和曲霉属最常见,在红曲中为红曲霉。在一些酒曲中检测到3个非酿酒酵母(叩囊覆膜酵、季也蒙毕赤酵母和粉状毕赤酵母)。通过DGGE图谱计算出的ShannoneWeaver多样性指数(H0)和辛普森优势指数(D)显示,在红曲和药曲中,细菌和真菌的菌落差异显著。Zheng等利用培养和非培养法(PCR-DGGE)相结合研究了汾酒大曲的微生物,在很大程度上利用DGGE与培养法得到的菌种重合,但是Weissellacibaria、Weissellaconfusa、腐生性葡萄球菌、产气肠杆菌、sanfranciscensis乳杆菌、乳酸乳杆菌和巨大芽孢杆菌只能利用DGGE确定。酒曲一般是自然环境下发酵,许多病原菌和微小菌参与到酒曲制作中,这对消费者健康具有潜在威胁。PCR-DGGE技术能评价传统酒发酵剂的质量,评估传统的发酵食品的微生物安全,监控潜在腐败微生物。Chen等利用PCR-DGGE对微生物的16S和18SrRNA基因片段扩增并分析结果显示,在制曲过程中,检测到11株细菌、9株杆菌和7株真菌,其中枯草杆菌和米曲霉是优势菌群。固态发酵剂“麦曲”用于中国黄酒发酵已经有数百年历史。Zhang等利用蛋白质组学分析绍兴黄酒麦曲。通过二维电泳得到145个蛋白质斑点,接着利用基质辅助激光电离解析-飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOFMS)定性,确定了10个真菌或细菌分泌的蛋白质、43个植物蛋白质和1个动物蛋白质。制作绍兴酒曲的主要菌种为米曲霉菌株SU16,Zhang等对绍兴酒曲中米曲霉SU16的分泌物首次进行综合分析,基于米曲霉基因组序列,利用双向电泳与MALDI-TOF/TOFMS对分泌物进行蛋白质组学分析,在分泌物中确定了41个特异蛋白,其中17个胞外蛋白质,其余为待定蛋白质