人工核酸内切酶技术在基因打靶中的应用

人工核酸内切酶技术在基因打靶中的应用

固定复杂的分组是生物基础研究和临床治疗的重要价值。20世纪80年代末诞生了第一个基因敲除的小鼠(Musmusculus)模型,科研工作者从此能够选择性地修改载有生命密码的基因组,探讨基因的功能。遗憾的是,在随后的20余年时间里,基因组靶向修饰技术仅限于能够在小鼠、果蝇(Drosophilamelanogaster)等极少数几个物种中实现。在这期间,人们始终在设法寻求具有普适性的新的基因定点突变方法。近几年,人工核酸内切酶(Engineeredendonuclease,EEN)技术的出现与完善使这个梦想逐步变成了现实。EEN是通过基因工程的方法,将特定的DNA结合蛋白跟特定的核酸内切酶相互融合构建而成的一种人造蛋白,它目前主要包括3种类型:锌指核酸酶(Zinc-fingernuclease,ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN),以及人工的大范围核酸酶(Meganuclease)。EEN主要包含两个结构域,一个是DNA结合结构域,用来特异识别并结合特定的DNA靶序列;另一个是DNA切割结构域,用来切割DNA靶序列,造成DNA双链断裂(Double-strandbreak,DSB)。DSB能够激活细胞内固有的非同源末端连接(Non-homologousendjoining,NHEJ)或同源重组(Homologousrecombination,HR)机制,对这种DNA损伤进行修复。其中NHEJ是一种较为简单的修复方式,但是保真度不高,很容易造成DNA断裂处的序列发生改变,产生DNA的小片段插入和/或缺失(indel),进而造成基因突变。在存在同源序列的情况下,还可以通过HR的方式进行修复,不过效率相对较低。有报道DSB能提高同源重组介导的DNA损伤修复的频率。根据上述特性,NHEJ途径和HR途径在理论上都可以用于对感兴趣的目的基因进行遗传改造。ZFN是第一种人工构建并成功应用的EEN,迄今已经发展了16年,这要归功于人们对于锌指转录因子和FokⅠ核酸内切酶的深入了解。虽然ZFN的出现大大促进了基因组靶向修饰技术,但是,由于锌指基序(motif)同其靶序列的对应性并不特异,对于每一个特定的靶点,往往需要构建庞大的锌指表达文库,通过实验筛选出高效且特异结合靶序列的锌指蛋白;而且在基因组上找到合适的ZFN靶点也比较困难。事实上,虽然人们已经开发出多种筛选方法,但是获得有效的ZFN仍然是一个相当大的技术难题。因此,人们一直希望能找到新的、核酸靶序列与蛋白质的motif之间对应性更强、便于预测的DNA结合结构域。幸运的是,2009年,有两个研究组同时报道,类转录激活因子效应物(Transcriptionactivator-likeeffector,TALE)就是这样一类理想的蛋白质。迄今仅短短3年的时间,基于TALE结构的人工核酸内切酶已经被成功地应用于包括芽殖酵母(Saccharomycescerevisiae)、果蝇、斑马鱼(Daniorerio)、线虫(Caenorhabditiselegans)、大鼠(Rattusnorvegicus)、水稻(Oryzasativa)、蟋蟀(Gryllusbimaculatus)、家蚕(Bombyxmori)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)与热带爪蟾(Xenopustropicalis)、猪(Susscrofa)和牛(Bostaurus)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)在内的多个物种,以及体外培养的哺乳动物细胞(包括人类细胞)(图1)。TALEN既能够像ZFN一样精确地修饰复杂的基因组,又具有比ZFN更容易设计的优点,对于遗传学的基础理论研究和应用研究来说,无疑都是一个重大的飞跃。由于在TALEN组装技术和模式动物应用上的突破,EEN介导的基因组编辑技术在2012年1月被NatureMethods杂志评选为2011年度最受瞩目、最有影响力的年度生命科学技术;2012年12月被Science杂志评为2012年度十大科学进展之一。Science在评述中把TALEN称为基因组的“巡航导弹”,还大胆预测TALEN技术将成为所有分子生物学实验室都要掌握的基本实验技能。本文将从TALEN的结构、构建及其在基因组定点修饰中的应用等方面介绍TALEN的研究进展。1tale蛋白的结构TALE蛋白家族来自一类特殊的植物病原体——黄单胞杆菌(Xanthomonasspp.)。早在1989年,人们就发现了该家族的第一个成员AvrBs3。TALE蛋白类似于真核生物的转录因子,它可以通过识别特异的DNA序列调控宿主植物内源基因的表达,从而提高宿主对该病原体的易感性。不过,直到20年后,人们才揭开了TALE与其靶位点相互识别的奥秘。TALE蛋白N端一般有转运信号(Translocationsignal),C端有核定位信号(Nuclearlocalizationsignal,NLS)和转录激活结构域(Activationdomain,AD),而中部则是介导其与DNA特异识别与结合的结构域。TALE蛋白的中部包含一段很长的、串联排列的重复序列,这种重复序列为这一蛋白家族所独有,是其DNA结合结构域的一个重要组成部分,具有特异性识别并结合特异DNA序列的特性。其序列重复的部分由1到33个长度为33~35个氨基酸残基的重复单位(或称重复单元)串联后,再加上末尾(C端)的一个含有20个氨基酸残基的半重复单位构成。也就是说,TALE蛋白的DNA结合结构域包含一段连续的1.5~33.5个重复单位,其中每个重复单位以及末尾的半重复单位可特异地识别并结合一个特定的核苷酸靶位点。在每个重复单位中,+12和+13位的氨基酸残基是实现靶向识别特异DNA碱基的关键位点,随靶点核苷酸序列的不同而异,被称作重复可变双残基(Repeatvariabledi-residue,RVD);其他位置的氨基酸残基则相对固定。不同的RVD能够相对特异地分别识别A、T、C、G4种碱基中的一种或多种,其中分别与这4种碱基相对应的最常见的4种RVD分别是NI(AsnIle)、NG(AsnGly)、HD(HisAsp)和NN(AsnAsn)(图2)。最近有两篇文献指出NH(AsnHis)作为一种RVD也能够高效识别G碱基,并且比NN的特异性高。由此可见,TALE的重复单元跟靶序列具有很好的一一对应性,因而在识别靶点的特异性方面比ZFN更有优势。2fki核苷酸内切酶TALE的应用中最引人注目的是TALE核酸酶(即TALEN)。研究人员首先尝试的是仿照ZFN的模式,把TALE中的转录激活结构域(AD)替换成核酸内切酶的切割结构域,构建成TALE核酸酶,对基因组的特定靶位点进行定向切割,从而实现基因打靶(图2,图3)。TALEN中通常使用的切割结构域来自于无序列特异性的FokⅠ核酸内切酶,FokⅠ的使用与优化主要得益于ZFN的研究成果。需要说明的是,FokⅠ通常需要以二聚体的形式发挥其切割DNA序列的功能,因此,无论是ZFN还是TALEN,通常都是成对使用。理论上,TALEN技术适用于任意物种,对于那些尚无成熟的基因打靶技术的物种而言尤为重要。一个物种能否采用TALEN技术实现基因打靶(得到可遗传的基因突变的个体)主要取决于两个因素:一是是否有有效的方法把TALEN(表达载体或mRNA)导入该物种的细胞或卵/胚胎(常用的方法包括转染、显微注射、病毒感染等);二是该物种的种质细胞/生殖细胞的基因组是否能够有效地受到TALEN的作用,从而产生突变,并且把突变传递到下一代。上述这两点实际上也是制备转基因动物的关键环节,因此,如果某个物种具备制备转基因个体的方法,那么,通过借鉴转基因的方法,这个物种应该很容易用TALEN技术制备可遗传的突变体。此外,TALEN跟体细胞克隆技术相结合,应该可以成为一条制备基因打靶大动物(猪、牛等)的有效途径。3tali-nt选择靶位点的原则TALEN应用的首要问题是靶位点的选择。2011年,Bogdanove和Voytas描述了选择TALEN靶位点的原则:(1)TALEN靶位点5′端的前一位(第0位)碱基应为胸腺嘧啶(T);(2)靶序列的第一位碱基(5′端碱基)不是胸腺嘧啶(T);(3)靶序列的第二位碱基不是腺嘌呤(A);(4)靶序列的最后一个碱基(3′端碱基)是胸腺嘧啶(T)(对应于最后的0.5个TALE重复单元);(5)在TALEN靶位点中4种碱基各占一定比例。根据目前收集到的所有TALE蛋白的结构信息,天然存在的TALE靶点的碱基组成为A=31±16%,C=37±13%,G=9±8%,T=22±10%。因此,潜在的TALEN靶位点的碱基组成应尽量遵从A=0~63%,C=11~63%,G=0~25%,T=2~42%。2012年,随着高通量TALEN合成技术FLASH(FastLigation-basedAutomatableSolid-phaseHigh-throughput)的产生,Joung实验室对TALEN的活性进行了大量的检测与比较,结果显示,TALEN靶位点选择只需要遵从上述的第一条原则即可。这样一来,对TALEN靶位点选择的限制越来越少,这样更有利于进行基因组的靶向修饰。随着更多TALE/TALEN相关论文的发表,人们对TALEN靶位点的选择原则也将会有越来越清晰的认识。为了便于利用TALEN开展研究工作,许多实验室建立了公开的网站帮助研究人员预测/设计TALEN靶点。Bogdanove和Voytas实验室最早建立了TALE-NT网站(/),利用该网站可以选择两侧TALEN结合位点所含碱基数量(等于对应的TALEN蛋白中所含RVD单元重复数量)及两侧位点间的间隔(Spacer)的长度范围,该网站还会在预测结果中标出Spacer中所含有的限制性酶切位点。TALE-NT支持用户自行选择是否遵从上述多条选择TALEN靶位点的原则,或是只遵从第一条原则。Joung实验室建立的ZiFiT网站(/ZiFiT/)需要用户指定希望产生DSB的碱基,该网站会给出该碱基周围的2对TALEN的预测序列。Zhu实验室建立了idTALE网站(.sa/),除了支持在用户提交的序列中进行TALEN位点预测之外,还提供输入拟南芥(TAIR10)、小立碗藓(Phypa1.1)、线虫(WS220)、果蝇(BDGP5.25)和酿酒酵母(EF3)这几种模式生物的基因ID进行直接搜索。4传统质粒载体的gate克隆策略当TALE与DNA特异性识别的分子密码被破解后,研究人员首先想到的是如何借鉴ZFN的策略,把天然的TALE加以改造,使其成为能够对特定的基因组位点进行靶向突变和修饰的工具。为了保证靶点在整个基因组中存在唯一性,靶序列一般会选择大于10bp。这样,就要求TALE需要含有至少9.5个重复单元,编码这一重复结构的核苷酸长度就会大于1kb,并且序列的重复性很强。因此,构建识别特定DNA序列的TALE就成为这一技术中的一个关键步骤和TALE应用中的主要瓶颈,人们为此发明了多种方法来解决这一问题。目前,除了可以选择全序列人工合成这一昂贵的方法之外,通过分子克隆的途径人工构建TALE的方法主要包括四大类:(1)基于GoldenGate(GG)克隆的方法:根据单体的不同来源可分为基于PCR的GG法(GG-PCR)和传统的基于质粒载体的GG法(GG-Vector);(2)基于连续克隆组装的方法:包括限制性酶切-连接法(Restrictionenzymeandligation,REAL)、单元组装法(Unitassembly,UA)和idTALE一步酶切次序连接法;(3)基于固相合成的高通量方法:包括FLASH和ICA(Iterativecappedassembly);(4)基于长粘末端的LIC(Ligation-independentcloning)组装方法等(表1,图4)。Zhang等最早把GoldenGate克隆的策略应用到TALE重复单元的构建,建立了GG-PCR法。他们利用了每两个相邻的TALE重复单元交界处的Gly-Leu双氨基酸残基的编码序列的简并性。有4个密码子编码Gly,6个密码子编码Leu,因此一共可以有4×6=24种不同的密码子(核苷酸序列)组合编码这两个氨基酸残基。这样就可以人为设计出24种不同的TALE重复单元的交界序列,作为相互特异连接的粘末端和构建特异结合引物的位点。在具体实验中,他们先使用多对特异识别不同片段的PCR引物分别扩增出每一种TALE重复单元(对应于在某个特定位置的某种特定的核苷酸靶点,例如第2位的T、第3位的A等),并在扩增的同时通过引物引入IIS类内切酶的识别位点。PCR产物经IIS类内切酶切割后,识别位点本身被切除,同时在每个片段两端各留下一个5′凸出的4碱基粘性末端,每4个(改进后为6个)相邻的重复单元的粘性末端是依序彼此匹配的,连接后可得到多组四联(或六联)重复单元。然后用能够分别与四联(或六联)重复单元中的第一个和最后一个单元特异结合的引物进行PCR扩增(同时再次引入IIS酶切位点),再次将PCR产物进行酶切-连接,可将四联(或六联)重复单元相互连接成更长的片段。重复上述PCR扩增、酶切、连接的过程,直到得到指定的长度(重复单元数),最后再将最终的PCR扩增产物整体连入带有转录激活结构域或DNA切割结构域的目的载体中。随后,在NucleicAcidsResearch杂志上接连发表了3篇、在PLoSOne上连续发表了两篇基于传统质粒载体的GoldenGate克隆策略(GG-Vector法)。以Yang实验室的GoldenGate克隆策略为例,他们利用了TALE重复单元中+18和+19位氨基酸残基Ala-Leu的密码子简并性,GC(A/T/C/G)(T/C)TG这8种密码子组合都能编码这种双氨基酸残基,藉此构建了一系列含有编码上一重复单元+18位到本重复单元+19位氨基酸残基序列的质粒(分别编码4种对应于不同碱基靶点的RVD以及8种简并密码子,共32个),并在紧邻这一编码区域外侧的质粒骨架上设计一个IIS类限制性核酸内切酶BsmBⅠ的识别位点。经BsmBⅠ酶切后,每个质粒可产生一个带有4碱基凸出的5′粘性末端。依序选择带有所需RVD的、粘末端依次匹配的模块,并加入跟第一个模块前端及第八个模块后端的粘末端匹配的质粒骨架,混合在一起进行连接反应,即可组装得到八联子重复序列。再经过第二次酶切、连接,即可获得识别16个或24个碱基的TALE重复序列。REAL方法由Joung实验室建立,他们使每个TALE基本单元质粒的5′端都带有ⅡS型内切酶BbsⅠ的识别位点,3′端都带有另一个ⅡS型内切酶BsaⅠ和普通内切酶BamHⅠ的识别位点。组装时,使用BsaⅠ和BamHⅠ双酶切前一个单元,产生一个序列特异的4bp粘性末端和一个序列固定的粘性末端(由BamHⅠ产生);同时,使用BbsⅠ和BamHⅠ双酶切后一个单元,产生一个跟前一个单元互补的序列特异的4bp粘性末端和一个序列固定的BamHⅠ粘性末端,两个片段连接后可形成TALE双单元。这样形成的双单元质粒中仍然具有BbsⅠ、BsaⅠ和BamHⅠ3个酶切位点,可用于重复进行上述的酶切-连接过程,构建更长的重复序列。如此循环进行酶切—连接反应,即可构建出指定长度的TALE重复序列。REAL-Fast方法是REAL的改进版本,它将REAL方法中的16种质粒(4种不同的RVD、4类不同的粘性末端)预先组装为二、三、四联子,一共得到384个质粒,以增加储备质粒的代价减少酶切-连接组装的步骤。Zhu实验室构建了一个含有100种不同的TALE重复片段的质粒库,其中的RVD单元来自天然的dHax3TALE蛋白,也是利用ⅡS内切酶和普通内切酶相结合的方式通过连续的酶切和连接构建TALE重复序列。FLASH方法采用的质粒材料和REAL-Fast相同,不过改用了在96孔板中的固相基质中进行酶切、连接,这样就可以省略每一次酶切-连接之后的细菌转化和生长这一耗时的中间步骤,从而能够实现快速、高通量地构建TALE重复序列。ICA是另一种固相合成的方法,其原理与FLASH类似,不过在每一步延伸连接的步骤中除了加入能跟上一步中间产物的末端相匹配的待连接片段之外,还采取了同时加入跟上上步的中间产物的末端相匹配的封闭片段的策略,以便减少不完全连接或错误连接的发生。LIC组装方法是设计多种TALE多单元片段,使其两端都带有较长的单链末端突出碱基(不少于10个碱基),这种带有长的片段复性后可以直接转化细菌,不需要经过连接的步骤;将序列彼此互补的多个长粘性末端的片段混和在一起,经退火处理后直接转化细菌,就可以一步得到所需的TALE重复序列载体。以上这些构建TALE重复序列的方法均存在一定的缺点:(1)基于GoldenGate的方法构建TALE一般都需要预先合成大量并且相似的质粒和引物,例如,GG-PCR法需要用到24条引物;GG-Vector法的每一位靶点都需要构建4种载体,分别对应4种可能的碱基;但是这4种载体中TALE重复单元的两端都需要带有相同的ⅡS型限制性内切酶的酶切位点,以便酶切后产生序列相同的粘性末端。如果标注不够清晰,质粒或引物之间很容易相互混淆。在连接反应中,只要有一个载体或引物出现问题(例如选用了错误的载体或引物),这个连接反应就会失败,或者得到错误的TALE重复序列。如果连接失败,不仅得不到连接产物,而且也很难判断是哪一个载体或引物有问题。(2)ⅡS类内切酶并非常用的酶,价格相对比较高。(3)FLASH和ICA技术虽然能高通量、快速地合成TALE重复序列,但是该项技术需要特殊的设备和试剂,并且FLASH往往需要通过一定规模的测序才能找到正确的连接终产物,同时也需要预先准备大量质粒片段。这类方法更适用于需要一次性大规模构建TALEN载体的实验室。(4)LIC所需的TALE长粘末端片段数量繁多并且序列复杂,例如,如果要构建整套的2单元TALE片段,各种粘末端接头的组合就有64种。“单元组装法”是本实验室建立的一种合成TALE重复单元的简便方法,其独特之处在于采用了“替代重复单元”(或称“旁重复单元”,alternativerepeatunit),从而能够利用氨基酸密码的简并性在这种重复单元的两端设计一对同尾酶(5′端SpeⅠ和3′端NheⅠ)的酶切位点,再加上一个辅助性的HindⅢ位点,这样就可以用相同的酶切策略、通过酶切-连接的循环操作构建任意长度的重复序列。例如,如果要构建识别AT双核苷酸的TALE双单元载体,可以用NheⅠ+HindⅢ双酶切识别A的单一单元模块载体,得到包含A单元的载体骨架长片段;用SpeⅠ+HindⅢ双酶切识别T的单一单元模块载体,得到包含T单元的短片段。将两者连接到一起,就可以构建出识别AT的双单元模块载体。由于SpeⅠ和NheⅠ为同尾酶而非同裂酶,由它们分别产生的两个粘性末端序列互补,可以相互连接,但是连接在一起后两个酶切位点均消失,而不能再被这两个酶切割。因而新构建出的双单元模块载体中只保留了双单元5′端的SpeⅠ和3′端的NheⅠ酶切位点。这与单一单元模块的酶切位点结构完全一致。这样,就可以用两个双单元模块载体重复上述酶切-连接的步骤,得到四单元模块;或者使用一个单一单元模块载体和一个双单元模块载体通过类似的步骤,得到三单元模块。依此类推,不断重复上述酶切—连接的步骤,即可构建出任意所需的TALE重复单元数(详见本期另文发表的实验指南“TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程”)。“单元组装法”的特点在于:(1)所需的起始载体数量少:所有的TALE重复序列都可以从最基本的4个单一单元模块开始构建;(2)载体具有累积效应:所有的中间载体(例如16种二单元、64种三单元和256种四单元模块载体)都可以保存下来、用于构建其它的TALE,使后续的载体构建变得越来越方便、快捷;(3)精确度和保真性好:不需要通过大量测序来筛选正确的克隆;(4)成本较低:只需要SpeⅠ、HindⅢ和NheⅠ这3种普通的常用限制性内切酶,成本相对较低,并且质量和活性有保证;(5)方法简单、技术难度低:只需要最基本的分子生物学知识就可以操作,不需要特殊的设备和试剂。因此,对于任意实验室,只要掌握了常规的分子克隆操作技术,就能很快掌握并应用这个方法。。5tale在fkisb中的应用在TALE重复单元的构建方法不断丰富的同时,TALE和TALEN技术的应用也迅速展开。2010年6月,Voytas实验室利用AvrBs3和PthXo1中天然存在的TALE重复序列分别跟FokⅠ融合,首次报道这种人工构建的TALEN可以切割目标DNA。由于DNA结合结构域与切割结构域之间的距离会影响到DNA靶位点中左侧和右侧TALE识别序列之间的距离(这两个识别位点之间的序列间隔称为Spacer),该论文在TALE重复单元区域之后保留了C末端235个氨基酸残基与FokⅠ结构域相连,研究了Spacer跟TALEN活性之间的关系。结果显示,对于这两个结构域之间这种长度的过渡序列,两个靶序列的间距应控制在13~30bp之间,其中15bp的效果最好。Yang实验室用来自AvrXa7和PthXo1中天然存在的TALE重复序列进行了类似的实验,并比较了将FokⅠ结构域连接到TALE结构域不同末端(N端或C端)构成的TALEN融合蛋白的效果。结果显示,FokI连接到TALE的C端时效率更高。2010年底,Sangamo公司首次报道利用全序列人工合成的TALE重复序列跟FokI的核酸酶结构域形成TALEN融合蛋白,在体外培养的人类细胞系HEK293和K562中分别对NTF3和CCR5等两个内源基因成功进行了定点突变。该论文同时报道,TALE重复单元数从9到24都可以跟目标DNA结合,其中16和18的效率较高;重复序列跟FokⅠ之间的距离(即保留来自TALE蛋白C末端区域的肽段的长度)范围可以为28~95个氨基酸残基,其中63个氨基酸残基的效率较高;而对于这种保留63个氨基酸残基的TALEN骨架(被称为“+63”骨架),靶位点中左侧和右侧两个半位点(Half-site,即单侧TALE的识别/结合序列)之间的DNA序列间隔(Spacer)可以在12~20个碱基之间。此后,自2011年起,TALEN迅速在多个物种中(绝大部分在个体水平)成功应用(表2)。Yang实验室利用TALEN成功地通过NHEJ和同源重组两种方式突变了芽殖酵母的多个内源基因。随后,Meyer实验室利用TALEN在线虫中诱导ben-1基因产生突变,首次在多细胞物种中实现了TALEN介导的基因打靶。2011年8月,Jaenisch实验室报道通过TALEN在人的诱导多潜能细胞(iPSC)和ES细胞中可以实现同源重组介导的基因敲入,其效率跟ZFN类似;Anegon实验室利用TALEN突变了大鼠的IgM基因;Yeh实验室和Joung实验室利用REAL法构建的TALEN在斑马鱼体细胞中得到了hey2和gria3a的突变,突变效率从11%到33%;本实验室同时报道利用单元组装法构建的TALEN对tnikb和dip2a两个基因成功打靶,并且获得了可以稳定遗传的斑马鱼突变体。2012年,Langenau实验室报道在斑马鱼中TALEN产生突变的效率比ZFN高,Ekker实验室及合作者共同报道,借助于TALEN产生的DSB,能够把短的单链DNA(Single-strandedDNA,ssDNA)(包含loxP序列)精确重组到斑马鱼的基因组中,为开展条件性基因打靶工作奠定了必要的技术基础。同时,TALEN技术的应用进一步扩展到了更多的物种:Zhu实验室利用TALE-SRDX抑制拟南芥基因的表达;Ying实验室在大鼠细胞中利用TALEN技术实现了对BMPR2基因敲除;Jiao实验室在果蝇中利用TALEN成功得到可以通过种系遗传的yellow基因突变;Yang实验室利用TALEN技术在水稻中敲除了Os11N3基因;Mito实验室利用TALEN技术成功地对蟋蟀的基因进行了定点突变;Xia实验室利用2对TALEN在家蚕中对BmBlos2基因实现了800bp的染色体片段删除;Sangamo公司在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中利用TALEN敲除了FUT8基因;Zhao实验室报道利用TALEN在两种爪蟾中成功实现了基因敲除;Fahrenkrug实验室则在牛和猪中实现了TALEN介导的基因敲除。6pcr扩增后凝胶电泳使用TALEN对基因组进行定点修饰的方案跟ZFN类似,主要是基于NHEJ和HR的各种应用。在TALEN的应用中,如何进行活性或突变效率检测是一个带有普遍性的问题。目前,对于检测体内(invivo)NHEJ引起的indel发生的效率而言,常用的方法包括直接克隆测序法、限制性内切酶(RE)酶切检测法和基于可以识别错配双链的错配内切酶检测法(主要采用CELI内切酶和T7E1两种酶)(图6);检测TALEN介导HR活性的方法则包括体外(invitro)的SSA(Singlestrandannealing)分析方法、体内或体外引入报告基因的方法和直接PCR检测重组是否发生的方法(后面两种方法只能确定是否发生了切割和修饰,无法估算TALEN效率)。采用限制性内切酶酶切检测法检测NHEJ引起的indel相对较为简单易行。这种方法依据的原理是TALEN造成的indel突变往往会导致Spacer中原有的酶切位点被破坏。使用这种方法只需要在设计靶点时,选择Spacer中带有一个独有的(Unique)限制性内切酶位点的靶点。检测时,提取基因组DNA在TALEN靶点两侧设计一对引物,通过PCR扩增出涵盖靶点区域的DNA片段(300~500bp为宜),用上述内切酶切割PCR产物并进行凝胶电泳。野生型DNA应该能够被完全酶切,产生1~2个较短的条带而经TALEN处理过的样品则会由于部分DNA的酶切位点发生改变而导致有一定比例的PCR产物未被切开(图5)。将未切开的条带回收后克隆测序,就可以检测具体的突变类型。根据本实验室的经验,电泳图中未被切开的条带的亮度(密度)占总条带的比例一般能直接反映TALEN的活性/效率。如果靶点中没有合适的酶切位点,则可以在PCR扩增后直接克隆测序,检测是否产生了一定比例的突变(克隆测序法)。不过,这种方法相对比较昂贵,如果TALEN活性不高,有可能需要测上百个克隆才能检测到突变。错配内切酶检测法主要是利用能特异性识别并切割杂合异源双链的内切酶。如果一个DNA样品(PCR产物)中有一部分序列带有inde突变,那么,该样品经变性—复性处理后将会形成一定比例的异源双链DNA(例如一条野生型链和一条带有indel的链杂交而成的双链),出现错配的区域。错配内切酶能够特异识别并切割这些区域,在凝胶电泳图上呈现为较短的条带。常用的错配识别酶有CELI内切酶和T7E1等,其中CELI酶以Transgenomic公司的Surveyor试剂盒检测法最为常用。SSA则是一种常用的体外检测TALEN效率的方法,一般用CMV启动子驱动的荧光素酶(Luciferase)作为报告基因。在报告载体上含有2个编码区不完整(因而无功能的)、但包含有一段相互重叠的同源序列的荧光素酶编码片段,2个片段之间被终止密码子和TALEN目标序列分隔开。如果TALEN能够造成该目标序列产生DSB,则DSB可诱导两段同源序列之间发生重组,产生出完整的有功能的荧光素酶编码序列,从而使荧光素酶的活性得以恢复。通过比较添加TALEN前后荧光素酶的活性变化,可以评估TALEN的活性。更多TALEN检测方法的详细介绍和使用范围比较,可参见本实验室建立的EENdb数据库。7tali在斑马鱼基因组的应用除了TALEN技术介导的基因组定点突变技术之外,TALE无疑还可以应用于对基因组进行其他的操作/调节。已有报道将TALE的DNA结合结构域与其他蛋白的转录激活结构域(例如VP16或VP16的四聚衍生物VP64)或转录抑制结构域融合,可分别激活或抑制靶基因的转录(表达)。不难预见,TALE还应该可以与甲基化结构域等其他功能结构域融合,从而实现甲基化基因组上的特定位点、研究表观遗传调控等等对基因组的其他定点操作。不过,通过用户定制的TALEN随意改造复杂的基因组,依然是TALE应用中最为吸引人的。毋庸置疑,TALEN技术对基础研究、生物技术和人类基因治疗等诸多领域都会产生重大影响,堪称基因组定点修饰技术的一场革命。它开辟了前所未有的方式来剖析任意物种的基因功能,还可以在同一个细胞系上利用TALEN技术产生不同的遗传病模型,为人类遗传病或后天的基因紊乱疾病开启了新的治疗途径。而像斑马鱼这样还无法通过胚胎干细胞(ES)途径实现基因打靶的脊椎动物,TALEN为其提供了有力的、不依赖于ES细胞的反向遗传学工具,为以斑马鱼为模式的基因功能研究带来了革命性的改变。但是,在不少物种中,TALEN的应用仍然局限于基于NHEJ的定点随机突变和筛选上;通过HR精确改变基因组的特定序列仍然存在一些难度。例如,对于斑马鱼而言,利用TALEN技术实现基于同源重组的基因组精确修饰,将使斑马鱼的反向遗传学技术得到进一步完善。最近,有报道短的单链DNA(ssDNA)可以精确地插入/置换斑马鱼的基因组。不过,该策略存在一定局限性和不确定性。例如,这一策略每次只能插入一个loxP序列,如果要实现条件性基因突变(靶基因两侧需要分别插入一个loxP序列),就必须连续进行两轮TALEN打靶,实验周期较长;目前还无法确定能否利用这一策略插入较大的外源序列(例如GFP报告基因);此外,短片段的供体序列有可能容易随机插入斑马鱼基因组,而在整个斑马鱼基因组中寻找/鉴定随机插入的仅为80bp左右的短片段供体序列在技术上显然存在不小的难度。这无疑会给后续研究带来麻烦和潜在的脱靶风险,这一问题仍有待实验评估。最近,本实验室采用含有GFP报告基因、传统的长双链DNA作为供体,在TALEN的介导下在斑马鱼中成功实现了同源重组基因打靶(相关的论文已被NatureMethods接受)。这一策略在理论上应该能够避免上述短片段供体DNA所带来的一系列问题,不仅能够插入较长的外源序列,而且还有可能缩短实验周期,同时很容易鉴定并区分供体序列在基因组中的随机插入与精确整合。随着TALEN技术的广泛应用和不断发展,斑马鱼在模式动物遗传发育基础理论研究以及疾病模型构建和药物筛选等应用研究中的地位无疑会显得越来越重要。虽然人们对TALE与靶序列识别与结合的规律已经有了较多的了解,其核心秘密——RVD与靶点的一一对应性——也格外地简单明了。但是在实际应用中,并非所有的TALEN都能够成功地引起靶基因产生突变。目前,本实验室已成功构建了100多对针对斑马鱼不同基因组位点的TALEN,经内切酶检测,突变成功率大于70%(未发表数据),这与Cade等人最近报道的结果类似。本