啤酒酵母水溶性多糖的分离纯化研究

啤酒酵母水溶性多糖的分离纯化研究

蛋白质是最重要的生物材料。它是细胞原生质的主要成分，在生物体中发挥着特殊的作用。蛋白质分子是由20种天然氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合,并具有特定的空间构象的高分子化合物。组成蛋白质的化学元素主要为C、H、O、N,在某些蛋白质中还含有P、Cu、Fe、I等元素,但氮元素的相对丰度基本稳定,是区别于其它有机化合物的标志性元素。由于不同的蛋白质所含的氨基酸比例及构成方式不同,各种蛋白质的含氮量也不同。一般蛋白质平均含氮量为16%,即1克氮元素相当于6.25克蛋白质,此即蛋白质系数。我们利用蛋白质的这一特性,主要采用半微量凯氏定氮法测定啤酒酵母水溶性多糖中蛋白质含量。啤酒酵母(S.cerevisiae)属真菌,是单细胞微生物。啤酒酵母含有25%-30%酵母多糖,主要是葡聚糖和甘露聚糖(MOS),葡聚糖具有抗肿瘤、促进和激活人体免疫力等作用,因而被称为“生化反应修饰物”(BRF)。它主要由β-D-(1,3)糖苷键连接聚合而成,周期性的分支点主要是β-(1,6)糖苷键。葡聚糖的分离方法是引起葡聚糖分子量变化的主要因素,在分离过程中将酵母葡聚糖进行磷酸化修饰,可以有效降低葡聚糖的分支度使它具有很强的免疫调节活性。另外,葡聚糖是低热量食品,不易消化,因而可以减少血糖含量,预防糖尿病。甘露聚糖可以防止病源菌在肠道里繁殖,减少肠道疾病,也可以作为免疫刺激因子,提高人体免疫力。在对啤酒酵母水溶性多糖进行分离纯化研究时发现,在粗多糖和纯化后的单一级份多糖中都含有一定量的蛋白质,本文主要通过对啤酒酵母水溶性多糖中蛋白质含量的测定,以进一步了解啤酒酵母水溶性多糖的功能、药用价值和作用机理,并为充分开发和利用这一真菌资源提供理论基础。1材料和试剂1.1材料表面实验材料购自广东丹宝利酵母有限公司。1.2试剂及试剂厂浓硫酸(哈尔滨理工化学试剂有限公司工厂批号:200301170);硫酸铜(沈阳市东兴试剂厂批号:20021025);硫酸钾(天津市四新化学试剂厂批号:20030710);硼酸(哈尔滨市化工试剂厂批号:051210);甲基红(崇明县裕安裕西试剂厂批号:820716);氢氧化钠(哈尔滨市金丽化工试剂有限公司批号:061018);盐酸(哈尔滨理工化学试剂有限公司工厂批号:200301230)。所有试剂均为国产分析纯试剂,均用无氨蒸馏水配制。1.3仪器与设备LNK凯氏定氮快速自动蒸馏器(中国宜兴市科教仪器研究所);LNK-872型多功能快速消化器(中国宜兴市科教仪器研究所制造);HDK-4型恒温定时控制仪(中国宜兴市科教仪器研究所);消化管架;250ml直消化管;微量酸式滴定管;电子天平(北京赛多利斯天平有限公司);DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司);752型紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。2实验方法2.1冻融法提取自分子中sa精密称取啤酒酵母15.000g,加20倍体积蒸馏水浸泡过夜,沸水煮提3次,每次一个小时,合并滤液。减压浓缩至50mL,加3倍体积97%乙醇醇析过夜,离心,常规干燥得水溶性啤酒酵母粗多糖SA。按照文献报道的方法,将SA反复冻融后,分别以体积分数为47%、57%、63%的乙醇进行分级,相应得到3个级份,其中以63%乙醇分级所得沉淀为主要级份,进一步纯化:经Sevage法脱蛋白、Sephadex6B凝胶过滤,得SA1。752型紫外分光光度计在波长280nm处分别检测SA和SA1是否有光吸收。2.2采用硅氮法测定了茶多酚的含量2.2.1消化非游离水将待测样品SA和SA1粉末置于称量瓶中,在105℃烘箱中烘干4h,用坩埚钳取出放入干燥器内,降至室温后称重,重复此操作,直至2次称重的质量数值不变,表明非游离水被去除,样品质量已达恒重,可用作消化。2.2.2混合催化剂的制备准确称取按如上方法烘干至恒重的多糖样品100mg,放入250ml直消化管底部,加浓硫酸5ml,加入混合催化剂(m(K2SO4)∶m(CuSO4)=5∶1)800mg,消化管置于多功能快速消化器中进行消化,直至消化液完全透明,呈现淡绿色为止,同时以0.1ml蒸馏水做空白试验,消化完毕,冷却至室温,消化液转入50ml容量瓶,以蒸馏水洗涤烧瓶数次,并入容量瓶中,定容到刻度,备用。2.2.3防回收滴液法精确吸取消化液5ml于消化管中,插接盛有样品的消化管;再取5ml质量分数为2%硼酸和1—2滴混合指示剂于锥形瓶中,放置锥形瓶,使凯氏定氮快速自动蒸馏器装置的防回收滴管置于硼酸液面以下。然后加入质量分数为40%NaOH溶液过量,至烧瓶内液体变为深蓝色;按下蒸馏开关,通气后关闭排废液阀;加热蒸馏至氨全部蒸出。2.2.4盐酸标准溶液体积消耗量的测定将上述馏出液用0.01028mol/L盐酸标准溶液滴定至淡绿色变为粉红色即为终点,记录盐酸溶液体积的消耗量,平行做三次,取平均值;同时做一空白对照。3sa和sa1的紫外分光光度计检测结果本研究中,按2.1,SA经冻融、乙醇分级后,取其中以63%乙醇分级所得沉淀为主要级份,进一步纯化,得SA1。752型紫外分光光度计在280nm检测SA和SA1均有紫外吸收,表明二者均含有蛋白质。按2.2,凯氏定氮法结果如表1。按文献,经计算,分别得出SA中蛋白质含量是7.36%,SA1中蛋白质含量是2.45%,见表1。4糖质蛋白食品SA1是由SA分级后纯化而得,在纯化中进行反复脱蛋白,仍检测到SA1中蛋白质存在;经苯酚-硫酸法测定SA1的糖分布,发现SA1中所含蛋白质的分布与糖分布相同,表明SA1中的蛋白质为结合蛋白质。啤酒酵母具有食用价值,其蛋白食品含有人体必需的8种氨基酸,尤其是谷类食物中缺乏的赖氨酸含量丰富,可以改善人类的营养均衡。作为营养型食品,测定其蛋白质的含量,是食品分析的主要内容之一