肝纤维化与gf信号通路

肝纤维化与gf信号通路

肝纤维是指由多种慢性疾病引起的持续肝脏损伤和修复反应的细胞外基质（cem）。过度沉积和肝脏功能受损。对肝纤维化的细胞及分子机制研究表明,多种细胞参与了肝纤维化的形成,其中激活的肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)是促进ECM过度沉积的主要细胞,而多种细胞因子参与了肝星状细胞的激活,其中转化生长因子β(transforminggrowthfactor,TGFβ)被认为是最关键的因素。其可激活肝星状细胞和调节ECM的合成和降解平衡。以干扰TGFβ及其细胞信号转导通路为靶点的抗肝纤维化治疗已成为当今研究的热点。这样一种具有多种生物活性的细胞因子对正常健康的维持同样非常重要,所以在TGFβ信号转导中对纤维化的形成具有特异性作用的下游通路将成为抗纤维化治疗的重要靶点。本文综述了TGFβ与肝纤维化形成的关系,相关的细胞信号转导通路及以此为靶点的抗纤维化治疗。1tgf受体的结构和功能特点TGFβ来源广泛,HSC、Kupffer细胞、内皮细胞、肝细胞等都可以分泌。目前认为TGFβ至少有6种亚型,哺乳动物主要是TGFβ1～33种亚型,其中TGFβ1是细胞和组织中最丰富的TGFβ成员,由于其启动子的调控较为复杂,其失控导致的疾病最为多见。在肝纤维化的发生发展与TGFβ1的关系也最为密切。根据TGFβ受体结构和功能特点,可将其分为3类,即TGFβⅠ型受体(TβRⅠ)、TGFβⅡ型受体(TβRⅡ)和TGFβⅢ型受体(TβRⅢ)。其中TβRⅠ和TβRⅡ跨膜区含丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)蛋白激酶结构域,具有细胞信号转导所必需的Ser/Thr蛋白激酶活性。TβRⅠ的胞质近膜区有一个特异的、高度保守的富含丝氨酸(Ser)/甘氨酸(Gly)的结构域,称为GS结构域,是受体激酶活性的作用区域。TGFβⅢ也称为辅助受体。TGF-β先与TβRⅡ结合形成受体复合物,同时激活TβRⅡ磷酸化激酶,TβRⅠ识别此复合物并与之结合,又被TβRⅡ磷酸化激酶磷酸化而激活,进一步启动细胞内信号的产生。2tgf/smad信号转导通路TGFβ信号转导主要通过受体丝氨酸/酪氨酸激酶途径及胞内的Smad蛋白途径,在过去的10多年中,Smad转导通路被认为介导TGFβ信号进入细胞核内的最主要途径,对TGFβ/Smad信号转导通路的分子基础及调控机制的研究也较为深入。肝纤维化中,HSC的激活分化及对胶原蛋白的合成等方面都受到TGFβ/Smad信号转导通路的调控。而越来越多的证据表明,非Smad途径也参与了TGFβ的信号转导。2.1聚体衍生物co-smad根据Smad蛋白在TGFβ家族信号转导中的作用,可将其分为3类:膜受体激活的Smads(receptor-activatedSmads,R-Smads),包括Smad1,2,3,5和8;通用Smad(commonmediatorSmads,Co-Smad),目前发现的只有Smad4;抑制性Smad(inhibitorySmads,I-Smads),包括Smad6、7,为TGFβ/Smad信号通路的抑制分子。TGFβ与其受体结合后可激活Smad2和Smad3并磷酸化,其与Smad4形成异源三聚体复合物易位入核,与DNA结合,通过和转录因子的相互作用调节靶基因表达。在整个Smad通路中,经过多步的磷酸化反应,核质穿梭运动及蛋白酶体的降解,最终由I-Smads终止反应。I-Smads由Smads信号诱导,在细胞核中聚积并在TGFβ刺激下被转运出核与TβRⅠ结合,通过阻止R-Smad磷酸化反应及R-Smad-Smad4复合物的形成及受体脱磷酸化而进行负反馈调节,TGFβ/Smad通路中各型Smads分子之间精密协调,共同完成生理及病理状态下TGFβ的生物学效应。2.2tgf调节的相关基因Smad通路并非TGFβ调节细胞功能的唯一通路,其他的信号转导通路包括丝裂原激活蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,MAPKs)、核转录因子-κB(nuclearfactor-kappaB,NF-κB)及磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3kinase,PI3K)/Akt通路等,这些通路可直接由TGFβ介导或者参与调节TGFβ-Smad通路的信号转导。实际上Smad信号转导通路与其他信号转导通路之间有广泛的串话(crosstalk),以此对Smad信号转导通路进行调节,并赋予了TGFβ多重的生物学活性。在一些细胞中Smad对一些TGFβ反应来说并非必要,甚至可能是通过MAPK依赖机制或其他途径。2.2.1tgf与mapk通路及其联合关系MAPK通路是目前有关与TGFβ信号转导中除Smad通路之外研究最多的通路。MAPK通路是激活后向核内转移并作用于核内转录因子的一个蛋白激酶家族。目前在真核细胞中已确定有4条MAPK信号转导通路:即细胞外信号调节激酶(extracellularregulatedKinase,ERK)、c-JunN-terminalkinase(JNK)、p38和ERK5通路。MAPKs可激活多种蛋白激酶、核蛋白及转录因子,而介导下游信号转导。在对TGFβ-Smad通路的深入了解的基础上,对TGFβ与MAPK通路的关系及其在多种器官的纤维化疾病中的作用也引起了广泛的重视。特发性肺纤维化过程中,TGFβ通过磷酸化p38MAPK及JNK而介导肺间质成纤维细胞的增殖。有学者研究发现p38MAPK在瘢痕组织成纤维细胞中参与调节TGFβ的转录。在糖尿病肾病中,TGFβ可增加p38、ERK1/2及JNK的磷酸化,诱导纤维结合蛋白(fibronectin,FN)合成增加。在肝纤维化中MAPK通路通过多种途径参与了肝星状细胞的激活、增殖、凋亡等过程。TGF-β通过上游的TGF-β激活激酶-1(TGF-β-activatedkinase-1,TAK1)和MKK3/6诱导p38MAPK信号的激活。HSC激活的过程中,TGFβ1mRNA的表达明显增加,阻断ERK活性后能有效抑制HSC自分泌TGFβ1的过程,也表明ERK信号通路参与了调控HSC自分泌TGFβ1的过程;分别阻断p38MAPK及Smad通路,HSCα(Ⅰ)型胶原基因表达降低,同时阻断两条通路抑制作用更为明显。Smad通路及MAPK通路分别独立并可协同的增加HSCα(Ⅰ)型胶原的基因表达,但TGFβ刺激α(Ⅰ)型胶原mRNA的稳定性增加是通过p38MAPK通路而非Smad通路。在HSC转分化的过程中,TGFβ激活MAPK信号转导通路,并进一步导致Smad3与Smad2的连接部位磷酸化,促进Smad3和Smad4复合体的形成及转位入核而发挥作用。2.2.2pka抑制剂的作用机制3′,5′-环磷酸腺苷酸(cyclicadenosine3′,5′-monophosphate,cAMP)是一种广泛存在的、介导多种激素细胞反应的重要第二信使,研究表明,cAMP途径参与了组织纤维化的形成。G蛋白偶联受体(G-proteincoupledreceptor,GPCR)激动剂通过Gs途径激活AC而刺激cAMP的升高,进而抑制胶原的合成。有学者在实验中发现,AC的激活及过度表达可抑制心肌成纤维细胞的形成及胶原的合成。磷酸二酯酶抑制剂、腺苷酸环化酶激活剂及外源性的前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)等可通过增加cAMP浓度而干扰TGFβ诱导的Smad特异性的基因转录。使用PKA(proteinkinaseA)特异性抑制剂H-89来阻断cAMP的主要下游通路PKA,可以抑制cAMP依赖性的Smad通路中的基因表达。共表达PKA催化亚单位及cAMP效应元件结合蛋白(cAMPresponseelement-bindingprotein,CREB)也可以抑制Smad通路中的基因转录。提示,cAMP通过PKA依赖性的、CREB介导的途径抑制TGFβ/Smad信号转导及后续的基因转活。2.2.3pi3-k抑制剂的激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3-K)是一个异源二聚体蛋白。PI3-K的激活对HSC的增殖和趋化性有重要作用。用PI3-K抑制剂LY294002和通过转染显性失活突变的Akt来抑制Akt,可明显减少HSC增殖及α1(Ⅰ)胶原mRNA和蛋白水平。用组成性表达Akt活性形式的腺病毒转化HSC,在低血清条件下可诱导HSC增殖。研究表明,PI3K信号转导通路可以被TGFβ调节。Bakin等在实验中发现PI3-K的抑制剂LY294002,可以阻止TGFβ1诱导的Smad2磷酸化反应,表明Smad蛋白也可能是PI3-K通路的一个靶点。TGFβ1可以激活PI3-K下游通路中的PDK-1及Akt,LY294002或Aktdn结构可以终止TGFβ1刺激的α2(Ⅰ)胶原基因的转录。另外,阻断PI3-K可以降低Smad3的活性。表明,在Smads和PI3K在调节TGFβ1介导的Ⅰ型胶原的表达中存在crosstalk。NF-κB为同源或异源二聚体的转录因子,HSC的激活与NF-κB异常持续性激活有关。NF-κB持续激活且IκB表达减少导致许多NF-κB的应答基因如IL-6、细胞间粘附分子-1(intercellularadhesionmolecule1,ICAM-1)在激活HSC中组成性的表达。NF-κB在保护激活HSC免受肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactoralpha,TNF-α)介导的细胞凋亡中也起重要作用。体内研究表明HSC激活时可伴有NF-κB的激活及c-myb基因表达的增强,而c-myb蛋白可结合于α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)基因的调控区,表明NF-κB及c-myb在HSC激活过程中具有重要作用。3化纤靶点TGFβ在肝纤维化中的重要作用决定了TGFβ及其信号转导通路成为了抗纤维化的主要靶点。国内外通过各种途径寻找干扰信号转导的策略,目前的研究包括对TGFβ本身的影响,干扰受体与配体的结合及其活性,以及针对后续信号转导的治疗等等,其中也包括中药和天然药物对肝纤维化治疗作用的研究。3.1细胞外基质细胞因子与tgf有研究表明,肾素-血管紧张素系统通过促进TGFβ的分泌合成而在肝纤维化的形成中具有重要作用,应用血管紧张素受体阻断剂及血管紧张素转化酶抑制剂治疗实验性大鼠肝纤维化,结果表明,TGFβmRNA水平剂TGFβ蛋白表达明显降低。在体外细胞培养及动物实验中也发现,重组的肝细胞生长因子对TGFβ及TGFβmRNA的表达具有阻断作用。另一方面阻断TGFβ的激活也具有重要意义。Thrombospondin-1(TSP-1),一种参与细胞损伤反应的细胞外基质蛋白质,被认为是TGFβ前肽复合物的重要激活因子。在二甲亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)诱导的肝纤维化模型中干扰潜在相关肽(latency-associatedpeptide,LAP)与TSP-1的相互作用,可以阻止肝脏的损坏及纤维化的形成这种因子在先天性肝纤维化中的表达增高。在DMN诱导的肝纤维化模型中,这种肽段可以通过抑制TGFβ的激活及后续的信号转导来阻止肝损伤及纤维化的进程。在细胞水平的实验中,中和激活的HSC中的TSP-1可以阻断TGFβ的信号转导通路。3.2对肝纤维化的作用大鼠注射表达dnTβRⅡ的病毒载体后连续使用DMN诱导肝纤维化,结果过度表达的dnTβRⅡ可降低DMN诱导肝纤维化的生成。Ueno等在实验中构建了可表达融合了人IgG的TβRⅡ外功能区的腺病毒载体,这种嵌合分子可以通过影响TGFβ的信号转导而减轻DMN诱导的肝纤维化。在肝纤维化大鼠中应用可溶性TβRⅡ(solubleTβRⅡ),发现可溶性TβRⅡ可降低胶原沉积,并可减少HSC的激活及增殖。其作用的发挥即通过可溶性TβRⅡ与胞膜TβRⅡ竞争性结合TGFβ抑制其信息传递。TGFβ中和抗体的应用是抗纤维化治疗的一个重要进展,TGFβ通过中和抗体中和循环中的TGFβ而阻止其效应。一种可以抑制各种TGFβ亚型的鼠单克隆抗体(1D11)对鼠肾脏纤维化的形成也具有抑制作用。把1D11用于胆管结扎(bileductligated,BDL)诱导的肝纤维化大鼠时,对组织学及纤维化分子标记物的分析也显示中和抗体由于抗肝纤维化治疗的有效性。3.3抗纤维化作用机制由于并非所有的TGFβ作用都应该被阻断,所以针对TGFβ的下游信号转导通路的阻断更具有特异性。Dooley等通过门静脉注射携带有Smad7cDNA的腺病毒载体,Smad7高表达的BDL大鼠胶原表达及羟脯氨酸的含量均降低。α-SMA的染色明显降低,表明HSC的激活受到抑制。更为重要的是,Smad7对体外培养的HSC的增殖及激活具有抑制作用,对已经形成的肝纤维化也具有影响。其主要机制是通过抑制Smad2/3磷酸化及活化的Smad复合物核转位来影响TGFβ的信号转导。另外一个可以特异性的阻断TGFβ下游信号转导通路的方法是阻断Smad3,在多种器官中均证实Smad3对纤维化反应具有调节作用。一种从大豆中提取的物质在培养的HSC中可以降低由TGFβ诱导的胶原聚积。使用p38MAPK抑制剂SB-203580及过氧化氢酶可以上调胶原mRNA水平,表明H2O2和p38MAPK信号转导参与了此胶原合成的调节,该提取物对HSC胶原的合成也表现出显著的作用。作用于p38