牛磺酸喂养对单眼剥夺大鼠视觉中枢神经型一氧化氮合酶阳性神经元表达的影响

牛磺酸喂养对单眼剥夺大鼠视觉中枢神经型一氧化氮合酶阳性神经元表达的影响

虚弱是视觉发育敏感期的一种不可避免的障碍。目前临床多采用心理物理方法治疗弱视,辅助药物治疗少且效果不确定,深入开展对弱视治疗药物的研究有广泛的临床需求。牛磺酸是中枢神经系统最丰富的游离氨基酸之一,目前被公认为是神经介质、神经营养因子和神经保护性因子,已有研究显示牛磺酸是人类和许多哺乳动物的必需营养物质,缺乏可导致严重的视功能障碍及发育异常,而补充牛磺酸可促进脑发育并对多种原因引起的视觉损害起保护作用。本研究拟通过观察牛磺酸营养干预对子鼠在视觉发育关键期单眼剥夺后视中枢nNOS表达活性的影响,从而探讨弱视的分子神经生物学机制,探讨牛磺酸药物治疗弱视的可能性及其机制。1材料和方法1.1河北省医学学院动物实验室新生健康雄性SD大鼠36只,体重6～8g,由河北省医学科学院动物实验室提供。随机分成3组,正常对照组(N)12只,单眼剥夺组(MD)12只,单眼剥夺牛磺酸喂养组(MD+Tau)12只。1.2大鼠脑层开孔相关神经元的检测1.2.1单侧眼睑缝合动物模型手术制作和饲养:大鼠至14日龄,在乙醚吸入麻醉下行左眼眼睑缝合术,术毕放回母鼠笼,眼睑裂开者不纳入实验。3组均笼养在同一饲养室的自然光线环境中,乳鼠生后22天断奶,正常和单眼剥夺组母鼠及断乳后子鼠用人工合成普通饲料喂养,牛磺酸组则用牛磺酸饲料喂养(在普通饲料基础上加入0.6%牛磺酸)。1.2.2实验动物养至28日龄处死并灌注固定,参照Paxion鼠脑立体定位图谱,修取视交叉至乳头体段脑块,在左侧大脑皮层下方及脑干下方用锋利的剃须刀片切矢状线做标记,以区分左右两侧。连续冠状冰冻切片贯穿整个视皮层V1区与外膝体,厚度40μm。切片经0.01molPBS充分漂洗后,使用抗nNOS多克隆抗体进行免疫细胞化学染色。每个皮层标本每隔3张切片取一张行Nissl染色。1.2.3光镜下观察并计算机图像分析:参照Paxion鼠脑立体定位图谱进行视皮层和外膝体定位和分区,各组视皮层阳性标本均与自身邻近切片的Nissl染色结果对照进行层的定位。将每组内每只大鼠右侧V1区视皮层及背外侧膝状体取在最大核团处连续切片各5～6张,在Olympus光学显微镜及IPP图像采集系统的10×10倍光视野下,测量nNOS阳性神经元在右侧视皮层V1区单眼反应区各层及外侧膝状体背核的数目。数密度用免疫阳性细胞数/切片核团面积表示。用Td2000真彩色病理、细胞图像分析系统,10×40倍光视野下,通过CameraLucida精确绘出每组V1区不同类型nNOS阳性神经元200个,测定其胞体截面积及树突总长度。1.3xs的表示所有数值均以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示。应用SPSS12.0版统计软件包进行单因素方差分析检验,P<0.05具有统计学意义。2结果2.1双极体神经系统中nas的表达2.1.1在视皮质V1区,nNOS阳性神经元散在分布于Ⅱ～Ⅵ层,以Ⅱ/Ⅲ层、Ⅴ和Ⅵ层为多,形态多样,胞体较大,突起明显,多数是双极和多极非锥体神经细胞,以成熟型为主。另外在V1区各层还有少量nNOS阳性神经纤维分布,纤维较细。2.1.2在外膝体,nNOS阳性神经元集中分布于外侧部,在背核呈散在分布,均为圆形或梭形的单、双极细胞,神经突分支很少。视皮层和外膝体阳性细胞形态学均表现为中间神经元。2.2图像的计算机分析2.2.1显著性分布p,q(MD+Tau)组、N组分别与MD组比较,在Ⅱ/Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ层均有显著性差异(P<0.05);(MD+Tau)组与N组比较,Ⅴ和Ⅵ层均有显著性差异(P<0.05),Ⅱ/Ⅲ层和Ⅳ层无显著性差异(P≥0.05)。见表1。2.2.2两组比较(MD+Tau)组、N组分别与MD组比较,均有显著性差异(P<0.05);(MD+Tau)组与N组比较,无显著差异(P≥0.05)。见表2。2.2.3视觉皮质中的nn阳性元音树突的长度MD组与N组比较有显著性差异(P<0.05);(MD+Tau)组与MD组和N组比较,均无显著性差异(P≥0.05)。见表2。2.2.4外侧膝状体背核的nnos阳性神经密度N、MD及(MD+Tau)3组两两比较,均具有显著性差异(P<0.05)。见表3。3讨论3.1单眼剥夺大鼠csad生命早期视觉经验对于维持视功能的神经组织发育是至关重要的,视觉剥夺可导致视系统内部神经元联结重组,使剥夺眼机能分离、生理功能丧失。本实验显示在大鼠视觉发育关键期(生后14～45天)缝合一眼导致本应由剥夺眼所优势支配的对侧视中枢因视网膜-膝状核突触退化而发生皮层和皮层下区域中NOS活性下降、NO合成减少,出现明显的弱视效应,说明单眼剥夺大鼠是一个研究视觉发育可塑性和弱视的细胞内分子机制的好模型。研究发现动物在发育的不同阶段合成牛磺酸的能力是不同的,CSAD(牛磺酸合成限速酶)途径是中枢神经系统牛磺酸合成主要途径,实验证明幼鼠组织中CSAD活性低于成年鼠,其脑牛磺酸在胎儿和新生儿期通过胎盘和乳汁由母体获得,后期主要来源于食物。本研究在子鼠出生后即给牛磺酸组母鼠喂养牛磺酸饮食,断乳后子鼠继续给予牛磺酸饲料喂养,观察出生即有牛磺酸供应的大鼠其单眼剥夺效应的不同。3.2牛磺酸对视网膜nas活性的影响牛磺酸在动物大脑皮层、小脑、嗅球、视网膜等区域含量相当丰富,中枢神经系统以神经胶质细胞和突触系统中牛磺酸最为丰富,其独特的分布显然与视网膜和脑的功能密切相关,而且大脑皮层兴奋型和抑制型细胞均富含牛磺酸,可能支持皮层细胞间信息交流。牛磺酸是视觉系统一种重要的神经化学成分,在视网膜的含量及浓度较高,并随动物的种属和年龄而变化;牛磺酸作为一种条件必须氨基酸,不但能影响视网膜视觉感受器发育,而且与视网膜的信息传递密切相关。牛磺酸转运体基因突变小鼠体内牛磺酸减少、生产力下降以及视力丧失,而后者是由严重的程序性死亡性视网膜退变所致。缺乏牛磺酸喂养的猫和猴,出现视力丢失、视网膜电图广泛异常、光感受器形态学改变、并殃及脑皮质的视觉区,进一步支持牛磺酸是哺乳动物正常视力发育的基本因素。本实验结合麋漫天等的研究显示,牛磺酸营养干预可通过显著提高视觉中枢nNOS活性及改变眼球、外膝体游离氨基酸含量,对视觉信号传导及视功能产生影响,并达到阻断剥夺性弱视的作用。但关键的早期单眼剥夺可能导致结构和功能的严重损害,单一的牛磺酸补充不能通过保留或恢复视中枢的正常功能构筑完全补偿剥夺影响。3.3nos在视网膜及视野组织化进程中的作用自1988年Carthwaite首次提出NO在神经系统的传导作用后,其在神经系统的作用越来越受到重视。NO作为一种逆行信使,有效地介导了细胞间的信号传递,介导神经元的发育、轴突的生长,并可能对视觉传导通路各区域间及区域内神经元间的相互连接进行修饰、精细化,最终建立正确的区域投射关系,形成正常的视觉功能。由于幼体的神经发育机制与成体的学习记忆机制有许多相似性,NO扩散性信使分子,通过强化或削弱突触连接,成为与学习相关的突触调节和神经发育中突触形成这两个过程中的共同分子机制。我们已知道大鼠视觉系统突触精细化调制发育与NOS表达时空相符,提示NOS活性与视觉发育的可塑性有关。GudeiroJ(1995)等认为NO可能转换并放大外膝体的视觉信号,调控视皮层细胞的反应。生后早期眼球摘除或剥夺弱视可以影响视网膜及视中枢NOS的发育。GuidoW等证明外膝体释放的NO是与中枢神经系统发育和突触可塑性有关的神经调质,成年期NO联合Ach释放以顺行方式影响网膜外膝体传输的增加和功效,发育期的NO以逆行方式维持网膜外膝体活性依赖精致下的连接过程。本实验也观察到单眼剥夺引起子鼠剥夺对侧初级视皮层单眼反应区及外膝体背核nNOS阳性神经元活性降低;牛磺酸喂养可以通过增加NOS的表达,弥补内源性NO合成不足,从而减轻子鼠视觉发育关键期的单眼剥夺效应,反映nNOS阳性神经元作为抑制性中间神经元的一个分支,通过神经递质NO影响内在外膝体背核和视皮层单眼反应区的运转及外膝体皮层交互作用。另外本实验显示单眼剥夺对接受外膝体投射的视皮层Ⅳ层nNOS阳性神经元活性无显著影响,考虑剥夺对外膝体及视皮层NOS的影响可能是通过不同的机制实现的。3.4no抑制nmda受体功能NO在神经系统内信息传递是通过NO-GC-cGMP环路完成的,NO在一个细胞内产生后,通过第二信使cGMP调控周围细胞的功能,局部调节着对立的或互补的细胞反应。NO亦通过此途径影响突触可塑性如长时程突触增强(LTP)、长时程突触抑制(LTD)。在兴奋性突触传递中,NMDA受体-NO-cGMP通路被证实普遍存在于LTP等过程,内源性NO介导了NMDA引发的兴奋性,成为NMDA的功能执行者之一,该过程存在于中枢神经系统,维持神经元的正常兴奋性,参与LTP的产生、维持及突触可塑性的建立。然而在生理条件下有活性的一系列有效地抑制同时限制这种串联,包括NO抑制NMDA受体功能,NO通过其活性依赖突触可塑性形式实现对突触功能的正负调节作用,动态改变皮层网络的有效强度,在大脑皮层信息处理中起重要作用。已经发现NOS神经元是GABA能神经元的组成部分,NO和GABA的释放是相互抑制的,且大鼠胚胎期及断乳前脑组织较高浓