小清蛋白在调节细胞内钙离子交换中的作用

小清蛋白在调节细胞内钙离子交换中的作用

1934年，德赫首次报道发现在鱼类和两栖动物的骨料肌纤维中发现小清蛋白（parvabumins，pv）。由于低分子量和高水溶性的特点,Pechere于1986年将其命名为小清蛋白。小清蛋白作为维持细胞内钙离子交换的钙结合蛋白,是脊椎动物体内肌浆蛋白的主要组成部分,在鱼类、两栖类和脊椎动物的肌肉中广泛分布,在肌肉的舒张运动中起着重要作用,同时也是对鱼类过敏的主要过敏原。1清蛋白的干合物小清蛋白是细胞内一种钙结合蛋白。钙离子参与了大量的细胞进程,如细胞运动、肌肉兴奋-收缩偶联、神经冲动传递、神经递质释放、膜通透性和细胞分泌过程等,小清蛋白能有效地调控细胞内钙离子交换,进而调控这些进程。在高等脊椎动物的肌肉中也发现了小清蛋白。研究表明,作为肌肉的舒张因子,小清蛋白不仅存在于两栖动物中,也存在于哺乳动物中。在快速收缩肌纤维中,小清蛋白是主要的可溶性钙结合蛋白,其基本机制是协助肌浆组织(sarcoplasmicreticulum,SR)和肌原纤维之间钙离子的交换,引起脊椎动物肌肉收缩-舒张循环,当钙离子从肌原纤维转移到SR时实现了肌肉的舒张。据推测,在快速收缩肌肉中,由于钙离子从肌钙蛋白C穿梭至SR中,使得小清蛋白促进肌肉的舒张运动。免疫组织化学研究证实,小清蛋白也分布于非肌肉组织中,如老鼠的牙齿、皮肤、脑、前列腺、精囊、睾丸、卵巢等。小清蛋白可能具有轴浆传送的功能,因为轴突内流动是一种钙离子依赖进程。有研究表明,5-HT1A受体广泛分布于大鼠大脑,是一种具有良好特性的血清素受体,参与精神抑郁症和其他精神疾病的中枢神经系统调控相关功能。免疫细胞化学双标技术显示,5-HT1A受体出现在钙结合蛋白D28k(CB)和含小清蛋白的神经元中,表明小清蛋白在大脑不同区域的关键作用。2对氨基酸序列的组成有所增加小清蛋白一般分为α和β两个不同的类型。α小清蛋白的特点是具有赖氨酸-丙氨酸(Lys-Ala)序列,在兔小清蛋白中对应于13-14位残基;而β小清蛋白在这个位置的序列为丙氨酸-丙氨酸(AlaAla)。除此之外,α小清蛋白含有的酸性氨基酸残基比β小清蛋白少,因此,α小清蛋白等电点高于β小清蛋白。确切地说,α小清蛋白和β小清蛋白可能会以等电点高于或低于4.8来进行区分。此外,人β小清蛋白氨基酸序列的第54位不同于α小清蛋白,并且缺少C端的第109个氨基酸残基。此外,α小清蛋白和β小清蛋白的差异也表现在对Ca2+和Mg2+等阳离子的亲和力上。例如,β小清蛋白结合Ca2+强于α小清蛋白。相对于α小清蛋白,β小清蛋白具有16%的Mg2+高亲和力,但有约200%的Ca2+高亲和力。一般而言,大部分肌肉只含有α或β类型的小清蛋白,但人和青蛙的快肌都同时含有α和β类型的小清蛋白。据观察,在相同或较低的蛋白浓度下,β小清蛋白比α小清蛋白能更大程度地提高肌肉舒张率。3小清蛋白氨基酸组成小清蛋白为酸性(pI为4.1~5.2)、低分子量(相对分子质量为10×103~12.5×103)、对Ca2+具有高亲和力(每分子含有2个Ca2+)的蛋白。生化检验表明,小清蛋白很少或不含脯氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、酪氨酸或色氨酸,但含有高浓度的谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸和组氨酸,且由于较高含量的苯丙氨酸而在280nm处的吸光度很低。比较兔子与大鼠肌肉中的小清蛋白氨基酸组成发现,兔子小清蛋白中存在一个脯氨酸而大鼠中完全不存在,但其他氨基酸组成都相似。高效液相色谱法分析表明,小鼠和人的小清蛋白、大鼠肌肉和大脑的小清蛋白具有相似的相对分子质量和等电点,经C-18反相柱的相同保留时间表现出相同的疏水性,尽管它们的胰蛋白酶肽谱不同。另外,在鱼类肌肉小清蛋白中不存在半胱氨酸而检测到高含量的丙氨酸,酪氨酸也仅发现于鱼类和鸡肌肉小清蛋白中。钙结合蛋白的一个共同结构特点是具有由约30个氨基酸残基组成的螺旋-环-螺旋蛋白模体的EF手图像(EF-hand)。X-射线衍射谱分析和主序列数据显示,鲤鱼小清蛋白三维结构包含6个α螺旋,分别为A、B、C、D、E和F,它们两两结合形成相同的蛋白模体,即EF手图像,每个EF手图像(模体)结合一个Ca2+。EF手图像成对存在,为小清蛋白提供了更加稳定的结构和功能。大量质谱和圆二色谱显示,小清蛋白的稳定性取决于它与Ca2+结合时产生的构象差异和重折叠能力。以4种鱼为材料进行研究,发现在90℃持续煮3h后小清蛋白仍保持稳定。小清蛋白的热稳定性指标被用来衡量鲶鱼不同小清蛋白异构体的个体发育表达情况。4免疫活性物质结合乙二醇ca2+Ca2+是所有的肌肉纤维运动的主要调控信号,因此肌肉纤维的收缩性能取决于参与Ca2+信号转导和处理的相关蛋白的数量。一些研究发现,小清蛋白作为可溶性舒张因子,大量存在于高等脊椎动物肌肉的快速收缩纤维中。然而,肌肉的生理表现,如收缩和舒张,依赖于各种肌肉蛋白,包括肌球蛋白、肌钙蛋白和其他肌原纤维的组成成分。从本质上讲,与小清蛋白一样,这些蛋白不仅能缩短收缩-舒张周期,还能结合游离Ca2+,减少细胞内离子的浓度,以防止细胞溶质Ca2+超载。长期的肌肉刺激可能导致小清蛋白饱和,降低其舒张能力。Ca2+解离率决定着小清蛋白能否从饱和度中迅速恢复。小清蛋白除了能结合Ca2+外,还能结合Mg2+。此外,Mg2+的解离率被认为是确定小清蛋白的生理特性及协助舒张能力的依据,尤其是在最长持续时间的收缩。然而,增加对Mg2+的亲和力,将会降低小清蛋白在快速舒张时的浓度,因此限制小清蛋白介导的缓慢收缩。小清蛋白不同异构体之间Mg2+的解离率可能不同,但目前尚未得到证实。虽然Gillis等的研究显示小清蛋白异构体在Ca2+和Mg2+结合上出现了小变化,但最近的研究表明不同种鱼在不同的小清蛋白Ca2+解离常数(dissociationconstants,KD)下,Ca2+结合亲和力不同。这使得人们更加相信,不同形式小清蛋白中也可能潜在着较大的Mg2+结合亲和力和解离率。Erickson等观察了2种南极鱼和2种温带鱼之间的Ca2+解离常数的变化,发现在它们生长的自然环境中Ca2+解离常数相似,但在相同实验温度下却不同。这说明,南极鱼小清蛋白在低温下才能维持其功能。因此,小清蛋白Ca2+结合行为的差异有助于理解在不同温度下肌肉生理生化和分子机制的变化。5小清蛋白的生物学功能5.1小清蛋白+ca2+-atp泵鱼类肌肉舒张率通常为纵向变化。小清蛋白是一种低分子量的蛋白,能结合Ca2+,因此能减少肌肉和神经细胞内的Ca2+含量。它帮助肌肉收缩后的舒张和增加神经元放电率。小清蛋白结合Ca2+的能力高于肌钙蛋白C,但低于肌浆组织Ca2+-ATP泵。Ca2+通过Ca2+-ATP泵回到肌浆组织中,生肌纤维中的Ca2+含量减少,小清蛋白与肌钙蛋白C竞争结合肌浆组织中的Ca2+,加速肌肉的舒张。鱼类肌肉中小清蛋白的含量范围为0~1.5mmol/L。特定肌肉中小清蛋白的含量影响舒张。较高含量的小清蛋白通常存在于脊椎动物快速肌肉中,即具有较高舒张率的肌肉。5.2属鱼肌肉小清蛋白的鉴定由于小清蛋白广泛的分布和物种特异性,成为研究不同物种之间亲缘关系的重要工具。小清蛋白是一种进化蛋白,一些亚型可存在于单一的肌肉细胞中。Hasnain等用聚丙烯酰胺凝胶对鳢属鱼肌肉小清蛋白进行电泳,发现鳢属鱼肌肉小清蛋白有3种亚型。此外,小清蛋白能反映动物物种之间的亲缘关系,初级结构比较发现兔子小清蛋白与骨骼肌肌球蛋白的碱性轻链(MLC-3)亲缘较近,这条轻链具有3个与鲤鱼肌肉小清蛋白钙结合域相似的区域。另一方面,从鱼肌质中获得一些物种特异性标记条带。广泛分布、物种特异性表达和独特的电泳迁移率的共同稳定合作,使小清蛋白成为一个具有良好前景的分子标记。因此,小清蛋白可以作为可信赖的标记,不仅能检测新鲜或热加工的产品,也可以检测腐烂的生物。5.3双脉冲抑制剂的调节γ-氨基丁酸(GABA)是主要抑制大脑皮层中枢神经系统的神经递质。GABA细胞相当于中间神经元亚群。实验表明,大鼠体感皮层含有小清蛋白,实际几乎只有在GABA神经元中发现。小清蛋白影响调节神经元兴奋性和活动性的神经组织的电气性能和酶素机构。因此,GABA皮质细胞的小清蛋白与调控抑制作用相关。Erickson等发现,鳕鱼大脑GABA能神经元的细胞体和突起含有大量的小清蛋白。它作为一个缓慢的Ca2+缓冲(Ca2+buffer),动作电位后可能影响细胞内Ca2+终端通道幅度和时间过程,因此,可调节短期的突触可塑性。双脉冲刺激应用于野生型和小清蛋白敲除型鼠的中间神经元和浦肯野(Purkinje)细胞之间的GABA能突触,可采用双脉冲抑制观察野生型老鼠及采用双脉冲易化观察小清蛋白敲除型鼠。然而,在中间神经元和浦肯野细胞连接配对结果中,用含EGTA的Ca2+缓冲液透析前突触中间神经元,可避免小清蛋白敲除型鼠双脉冲抑制。这表明,小清蛋白能高效地微调短期突触可塑性。此外,小清蛋白在中间神经元的表达有助于形成和维持参与α1亚单位GABA受体的海马γ摆动(γ-oscillations)[12,13,14,15,16,17]。在GABA能突触的作用下,小清蛋白在中间神经元的表达与皮层神经元同步。这一过程涉及神经元信号分子的表达差异。细胞信号分子的差异表达和相对频率,反映了在神经网络中小清蛋白阳性中间神经元对GABA能释放具有短时作用。因此,小清蛋白有助于肌肉的放松,并增加组织神经元的放电率。小清蛋白的表达有助于维持GABA能神经元网络的稳定性,其抑制作用的改变是癫痫发作的主要原因。小清蛋白缺陷型(PV-/-)小鼠癫痫发作的严重程度明显大于野生型。因此,在高诱导、高频率刺激下,小清蛋白的缺陷促进了GABA能电流感应,这个机制依赖小清蛋白促使海马产生癫痫。此外,小清蛋白和钙结合蛋白D28k的缺乏将破坏浦肯野细胞放电率和节律性的调控。小清蛋白和D28k双基因敲除的小鼠双频率振荡(110和240Hz),与浦肯野细胞放电行为的改变有关,表明钙瞬变控制能够导致正常心律失常和浦肯野细胞的异步放电模式。相比之下,小清蛋白和D28k在浦肯野细胞中共同表达,而D28k在神经细胞也完整表达。5.4低中国鱼类小清蛋白尽管已在高温下烹煮和接触胃肠道酶,小清蛋白仍能使易感人群过敏。由于小清蛋白在高温和蛋白酶作用下的高稳定性,小清蛋白对敏感病人有害。如今,鱼类过敏被认为是最常见的食物过敏症之一。经IgE抗体证实,从不同的鱼中纯化出来的小清蛋白使超过95%的人对鱼类过敏。所有患者皮肤点刺试验阳性结果显示这些鱼类促使大多数病人释放嗜碱性组胺。现已证实,小清蛋白不仅在鱼类,也在青蛙肌肉中具有高含量。Hamada等研究了对鱼类过敏的病人是否对从牛蛙中纯化出来的α和β型小清蛋白都有反应。来自14位患者的12份血清经ELISA测试,均对从牛蛙中纯化出来的2种小清蛋白做出反应。对鱼类小清蛋白阳性反应的12份血清中的8份对牛蛙α和β型小清蛋白做出反应。进一步研究显示,在食用蛙肉时,青蛙α小清蛋白是造成IgE介导的过敏反应触发的原因。由于小清蛋白在鱼类和两栖动物中普遍存在,随着对这2类动物或其产品消费的增长,相应的食物过敏现象也将日益增加。最近关于治疗鱼类过敏的研究表明,鲤鱼小清蛋白进入Ca2+结合域的位点诱变方法获得了惊人的结果。在这项研究中,21名对鱼类过敏的患者血清出现突变(Mut-CD/EF),95%降低了IgE的反应性,在低过敏反应也出现一些衍生物。突变体免疫治疗潜在适用性的成立是突变分子免疫的结果,不同鱼类小清蛋白与IgG抗体发生交叉反应,从而抑制鱼类过敏患者IgE与野生型过敏原结合。因此,低过敏性鲤鱼小清蛋白突变体(Mut-CD/EF)的应用,可能会成为治疗对鱼类过敏的免疫疗法。同样,将中鲤鱼肌肉小清蛋白mRNA导入λgt1噬菌体表达获得的鲤鱼重组小清蛋白,有可能用于IgE介导的对鱼类过敏症病人的检测。5.5大鼠睾丸发育期间小清蛋白免疫反应除了上述生物学功能外,小清蛋白也参与内分泌调节。据了解,Ca2+参与精子的产生和分泌,从而调节睾酮,而Ca2+与细胞内的一些钙结合蛋白,如小清蛋白、肌钙蛋白、S-100蛋白和钙调蛋白等相互作用。这4种蛋白以不同浓度存在于成熟的