ph和nacl浓度对丝胶蛋白聚集微观结构的影响

ph和nacl浓度对丝胶蛋白聚集微观结构的影响

丝胶蛋白功能生物材料的研究近年来，微胶囊、可口服复合物或片剂的多功能生物载体的应用越来越受到重视。生产生物载体的原材料应具有一些特殊性能,如在pH、离子强度、温度和浓度等条件下具有合适的粒径,形成合适的聚合形态以及特殊微观结构。目前这类材料多是化学合成,材料的安全性日益引起社会关注,天然无害的生物材料将成为健康安全食品医药的新趋势。在过去的几十年里,蛋白质和多糖等生物大分子聚合物已经引起科学家的注意。应用这些材料制备生物载体,必须先了解材料的基本物理化学特性。pH和盐对生物材料影响的相关理论、模型和试验数据已经有大量的研究报道。丝胶是包覆在丝素蛋白外层的具有粘性的、水溶性的球状蛋白。大量的研究证明,丝胶具有抗氧化、抗紫外辐射、抑菌、抑制酪氨酸酶和激酶活性等功能活性,且吸水性和持水性良好。因此丝胶具有作为多重功能活性生物材料的潜能。目前关于丝胶蛋白基本物理化学性质的研究相当有限,限制了丝胶蛋白作为生物材料的应用。本文研究了pH和NaCl浓度对丝胶蛋白粒径分布以及微观结构等物理化学特性的影响。采用Zeta电势法测定了丝胶蛋白的等电点,探讨了丝胶蛋白表面电荷随环境pH和离子强度变化的影响。应用动态光散射法(dynamiclightscattering,DLS)探测了丝胶蛋白颗粒的粒径分布和变化,结合透射电镜(transmissionelectronmicroscopy,TEM)和近红外光谱(infraredspectroscopy,IR)分析了丝胶蛋白聚集的微观结构和构形变化,为丝胶蛋白生物材料的应用提供了理论依据。1材料和方法1.1除杂质,润洗润洗桑蚕(Bombyxmori.L)蚕茧剪成约1cm2大小,用自来水仔细淘洗去除杂质,用蒸馏水润洗。洗净的蚕茧以25∶1(w/v)的比例加蒸馏水于沸水下煮2h,收集丝胶溶液、浓缩、冻干备用。1.2na4r65FTIR光谱分析采用NicoletMagna4R560,分辨率为4cm-1。干燥的丝胶蛋白粉末与FTIR级KBr混合均匀,压成薄片,即刻进行FTIR扫描。1.3zeta电势的测定采用ZetasizerZS-90电势粒径仪(MalvernInstrumentsLtd.,Malvern,UK)测定丝胶蛋白溶液的zeta电势。丝胶蛋白浓度为0.2mg·mL-1,用HCl和NaOH调整pH后立即测量。1.4关于系统固有定理的测量,有相关说明的说明,有以下几个采用基于电荷斥力和范德华吸引力平衡的DLVO理论模型来建立丝胶蛋白颗粒聚集模型。胶体系统的相对稳定或者聚沉取决于斥力能和吸力能共同作用结果的推斥能VR的大小,推斥能VR随粒子间距离x的变化而变化该模型在相关文献中有详细论述。VR=Aψ2exp(−κx)(1)VR=Aψ2exp(-κx)(1)其中A为系统固有常数,ψ为zeta电势,κ-1为粒子双电子层的Debye-Huckel长度或厚度κ=B⋅I√(2)κ=B⋅Ι(2)其中B是电解质溶液的固有常数,I是离子强度,离子强度可以用电导仪测定。由方程(1)和方程(2)推导出方程(3)x=ln(Aψ2VR)/BI√(3)x=ln(Aψ2VR)/BΙ(3)当VR=1kT时,方程(3)可以简化得到方程(4)x∝ln(|ψ|)I√(4)x∝ln(|ψ|)Ι(4)方程(4)中,粒子间的距离与zeta电势的对数ln(|ψ|)成正比,与离子强度I1/2成反比。1.5mw瞳余光粉的表征丝胶粒径采用NICOMP380ZLS-Zeta电势/粒径仪测定,工作条件为5mW氦氖光源,波长632.8nm,散射角度90°,温度25℃。丝胶浓度为0.2mg·mL-1,经0.45μm过滤器过滤,样品用HCl或NaOH溶液调整pH。计算机自动对光密度进行收集,采用累积分析法得到丝胶蛋白粒径及其分布。1.6扫描电镜sem采用JEOLJEM-1230透射电镜对颗粒的微观结构进行了扫描,电镜工作电压为80kV。取一滴0.2mg·mL-1的丝胶蛋白溶液置于铜网格上,多余的溶液用无尘滤纸移除,空气中风干约10min,将铜网置于在透射电镜下扫描。2结果与讨论2.1蛋白结构的测定图1为丝胶蛋白冻干粉末的IR光谱,图谱中只有酰氨Ⅰ带1700～1600cm-1附近有较强吸收峰,主要是蛋白质中CO伸缩振动引起,一般认为,β-折叠和无规则卷曲分别在1630和1650cm-1附近有较强吸收,因此可以确定丝胶蛋白主要含有β-折叠和无规则卷曲结构,这与大多数文献的结论一致。也有学者认为丝胶蛋白中含有大约不到11%的α-螺旋。2.2zeta含量测定丝胶蛋白表面电势试验测定了0,0.06和0.9mol·L-1NaCl溶液中的丝胶蛋白在不同pH下的zeta电势(图2)。由图可知,0mol·L-1NaCl,低pH值时,丝胶蛋白的表面电势为正值,当pH值低于3.0时,电势达到稳定,约35mV;高pH值时,电势为负值,当pH值高于5.0时,电势达到稳定,约-45mV。0,0.06mol·L-1NaCl溶液中丝胶蛋白的等电点pI为3.7,这结论与Kodama用沉淀法测得的3.9非常相近。0.06mol·L-1NaCl丝胶溶液在pH值为2～3时,zeta电势值降至20mV。在0.9mol·L-1NaCl溶液中,由于丝胶蛋白的表面电荷被相反电荷的离子屏蔽,无法测定。2.3动态光散射法检测丝胶蛋白的微观结构,主要考当一对粒子带有相同电荷,静电排斥力会阻止凝聚的发生;如果颗粒带电为中性,范德华力和氢键有利于形成凝聚,从而增大颗粒粒径。在方程(4)中,根据粒子间距离的变化,确定粒子凝聚的可能性。当离子强度不变时,可以得到方程(5)来表达粒子间距离xx∝=ln(|ψ|)(5)x∝=ln(|ψ|)(5)ln(|ψ|)越大,意味着粒子间距离越远,也就是说粒子越难聚集;相反,ln(|ψ|)越小,说明粒子越容易聚集。图3(a)中可以看到,随着pH值远离pI而增大,在pI附近时最小,这一模型跟光散射测定的结果一致。图4为丝胶蛋白在pH4,8和3时的TEM照片。在pH4[图4(a)]时,可以观察到丝胶蛋白聚集且微观结构非常紧密,由许多球状单体堆叠在一起,球状单体的粒径约为(60±6)nm(随机选取照片中10个单体计算所得)。相反,在pH8[图4(b)]时形成相对疏松的松枝状结构。在pH3[图4(c)]时形成类似pH8时的松针结构,但相对紧密。但在pH3和8时,延伸的分枝体代替了pH4时的紧密单体小球。这种现象可能归结于静电排斥力引起的无规则聚合链的排斥体积增加。聚合物链单体被排斥的部分都会被其他单体占据重叠,从而促成聚合物链的延长。pH=pI时,聚合物容易聚集在一起,而在pH远离等电点时蛋白颗粒膨胀延伸。此外,IR光谱的未随着pH的变化而变化(数据未列出),也就是说丝胶蛋白的二级结构未受到pH的影响。基于以上动态光散射的测量、聚集模型的建立以及透射电镜扫描的结果,可以认为丝胶蛋白聚集的构形和微观结构都是静电排斥力和吸引的范德华引力和氢键共同作用的结果。相关文献中pH对β-乳球蛋白,大豆蛋白等产生了类似的影响,如β-乳球蛋白在等电点5.1时会形成八聚体,在酸性或者碱性条件下又会解聚。2.4蛋白单体的结构表征图3(b)为光散射法测定丝胶蛋白颗粒粒径随盐浓度变化的结果,其中pH恒定为8。当NaCl浓度从0mol·L-1升高到0.1mol·L-1时,丝胶蛋白的粒径从350nm迅速上升到900nm,同时多分散系数也从0.6提高到1.8。当NaCl浓度升高到0.9mol·L-1时,粒径稳定在约860nm大小,多分散系数也从1.4变化到2.4。这些都表明,溶液中的NaCl使丝胶蛋白颗粒的聚集,而且NaCl为0.1mol·L-1时会开始形成最大的聚集。粒子间距离x可以从方程(4)推导得到方程(6)x∝=ln(|ψ|)/I√(6)x∝=ln(|ψ|)/Ι(6)电势值可从图2中获得,如0mol·L-1NaCl浓度时,zeta电势为-50mV,如0.06mol·L-1NaCl浓度时,zeta电势为-23mV。由于蛋白质本身是一种电解质,即使在没有添加NaCl时,其离子强度为3×10-5mol·L-1。从图中可以看到溶液NaCl浓度为0.06mol·L-1时,迅速下降,说明0.06mol·L-1的NaCl会促进丝胶蛋白的聚集。图5是在0.06和0.09mol·L-1NaCl下丝胶蛋白微观结构的TEM照片。如前所述,pH8时,丝胶蛋白表面的静电斥力阻止了蛋白的聚集。而加入NaCl后,蛋白表面电荷被相反离子(如Na+)屏蔽了,从而导致了蛋白的聚集。在TEM照片中,可以观察到丝胶蛋白聚集成微晶,这些微晶主要由β-折叠结构组成。通过吸收水分丝胶蛋白的无规则卷曲可以通过拉链式氢键链的形成转化成β-折叠,甚至在干燥的条件下也可以保持结晶态。低严浓度下[0.06mol·L-1NaCl,图5(a)]丝胶蛋白的微观结构比无NaCl时[图4(b)]更紧密。相比在低盐浓度下,高盐浓度下[0.9mol·L-1NaCl,图5(b)]丝胶蛋白表面电荷被彻底屏蔽,凝聚相对更紧密和集中。类似的盐促成蛋白质沉淀在乳清蛋白和大豆蛋白的研究也有报道。基于以上分析,丝胶蛋白单体在等电点时为紧密的球形,易形成紧密的凝聚体且聚集是无规则的。当pH远离等电点时,丝胶蛋白单体膨胀,由于丝胶蛋白单体表面电荷分布不均匀,单体间的聚集具有选择性。没有盐的条件下,丝胶蛋白形成松枝状聚合物;添加NaCl后,丝胶蛋白会大量聚集成微晶状。3p