竹类植物分子育种研究进展

竹类植物分子育种研究进展

竹子是地球生态系统的重要组成部分。它生长迅速，用途广泛。不仅具有重要的经济价值,而且具有良好的水源涵养和水土保持功能。竹林是经济效益和生态效益良好结合于一体的林种,利用价值和生态价值极高,比同面积的森林多放氧35%,被公认为21世纪世界上最重要的植物资源之一。有人认为“没有竹子,陆地将没有生命”。此外,竹子具有似草非草、似树非树的特性,并且它是森林资源的重要组成部分,能产生的巨大经济效益,因此竹类植物研究愈来愈受到重视。目前在竹子分类、生长、繁殖、形态结构、竹材理化性质和加工利用等方面的研究已取得很多成果并得到推广;竹子遗传改良研究也取得了一定进展。然而,竹类植物的分子生物学研究目前严重滞后于禾本科的农作物如水稻[12～21],本文中,简要综述了竹类植物的分子生物学研究现状,并提出竹类植物研究的重点和发展方向。1竹类植物总rna提取和分子标记酶植物DNA和RNA的提取是进行植物分子生物学研究的第一步,对后续试验工作的开展尤为重要。由于竹类植物的糖类和酚类含量高,一般很难提取到适合研究用的RNA或DNA,所以许多研究者致力于提取方法的改进研究,并将此部分经验总结成文,这些有效的和提取方法为进一步开展竹类植物分子生物学研究提供了良好的基础,如提取的DNA可用于分子标记、基因分离提取的RNA可用于RT-PCR、Northern杂交、cDNA文库的构建等研究。周明兵、汤定钦提出一种适用于小佛肚竹Bambusaventricosa和螺节竹Pleioblastusgramineus等竹类植物总RNA提取方法,该方法操作简便、无DNA污染,且产率高。普晓兰等用改良CTAB法从巨龙竹硅胶干燥的叶片中提取基因组DNA,并成功进行RAPD扩增。2竹子育种研究分子标记从20世纪80年代开始应用于竹子研究,主要进行群体间和群体内DNA(包括核基因组DNA和叶绿体DNA)水平上遗传变异的研究,以阐明竹种群体分化的遗传学和生态基础。利用分子标记技术研究竹子遗传分化是竹子育种的一个热点,通过研究初步阐明了竹子的遗传变异,为竹种的育种和分类提供了理论依据。同时用于不同竹种间的分类学研究,以弥补传统分类方法的不足,进一步明确了竹种的系统分类地位。这些研究主要采用RFLP、RAPD和AFLP等分子生物学方法。2.1刚竹属竹种的遗传多样性RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。Friar等利用RFLP技术对刚竹属竹种的遗传变异、分类学及系统进化进行了研究,通过计算遗传距离检测种内和种间遗传变异的程度,并对37种竹种的基因组DNA用EcoRV,HindⅢ消化和10种探针进行分析及后来用3种不同限制性内切酶对20种Phyllostachys的DNA进行消化,发现每一种酶、探针组合都呈现多样性,这是首次应用DNA多样性对竹子进行研究。Kobayashi等借助RFLP技术研究了竹子叶绿体DNA的多态性,Watanabe等用15种限制性内切酶对亚洲包括热带属和温带属的16个竹种叶绿体DNA的分析进行了分析,认为叶绿体DNA多样性对系统发育研究是有价值的。2.2苦竹与表土、超基化竹的rapd基因测序和聚类研究RAPD(RandomAmplificationPolymorphicDNA,随机扩增多态性DNA)简单、实用,主要用于基因组的鉴定、特征标记和作图,近20年来国内外一些研究者对竹子开展了大量的RAPD研究工作,为今后早熟、高产、优质、抗逆竹子遗传性状改良提供了分子鉴定基础。吴益民等利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对考顺竹、凤尾竹、绿竹和白绿竹4个品种,用20种引物进行PCR扩增,其中有17种可扩增出DNA条带,构成RAPD指纹图谱,4种竹子两两之间的相似系数在36%～73%之间。杨光耀、赵奇僧利用RAPD技术分析了苦竹类植物,采用20个引物用于种间遗传相似性分析,结果表明苦竹与宜兴苦竹关系密切;大明竹与其它4种关系较远;形态上将中国产、日本产苦竹分成2类,但没有得到RAPD分析的支持。庞延军等采用RAPD的实验方法,研究了肿节少穗竹Oligostachyumoedogonatum与4个近缘竹种的关系:在DNA水平上肿节少穗竹与酸竹属Acidosasa的其它物种存在明显差异等。师丽华、杨光耀利用RAPD标记技术将7个毛竹的变型或栽培型同属的2个近缘种明显区别开来。廖国华报道了由37个随机引物扩增出的毛竹黄、白笋个体RAPD指纹图谱,从分子水平上证实了毛竹黄、白笋个体存在真实的遗传差异。方伟等对雷竹的19个栽培类型及2个近缘种进行了RAPD分析,聚类结果可将雷竹的不同栽培类型及其近缘种区分开来,以前认为是雷竹一栽培型的永嘉雷竹不属于Ph.praecox种系。普晓兰等对巨龙竹Dendrocalamussinicus种下具有2个明显不同的变异类型“通直型”和“歪脚型”进行了RAPD分析,结果表明歪脚类型的遗传多样性高于通直类型,巨龙竹变异类型群体之间及群体之内均出现显著的分化。另外,Hsiao等利用RAPD技术分析了台湾玉山竹Yushanianiitakayamensis(Hayata)Kengf.5个样品的群体遗传结构并对无性系进行了鉴定。邢新婷、傅懋毅以麻竹DNA为模板,对影响麻竹RAPD扩增的重要参数进行优化试验,建立了RAPD反应的最适体系;同时邢新婷、傅懋毅采用随机扩增多态DNA(RAPD)方法对6个群体30丛撑篙竹个体进行了遗传变异的研究,28个随机引物共检测到173个位点,其中85个是多态位点。同时用UPGMA方法将不同产地的撑篙竹6个群体聚为3类。Das等结合RAPD方法并进行克隆和测序,发展了SCARs(Species-specificMarker)标记法来鉴定Bambusabalcooa和B.tulda2种竹子,这是SCARs标记法应用于竹子研究的首篇报道。总之,RAPD和SCARs等分子标记方法在过去的20多年中已成为研究竹子分子分类的有力工具,在分子水平上探讨竹类植物的遗传变异发挥了应有的作用2.3不同种类竹子的遗传稳定性研究AFLP(AmplicationFragmentLengthPolymorphism,扩增性片段长度多态性)。就DNA多态性而言,AFLP的灵敏性要优于RFLP、RAPD等分子标记技术。AFLP分子标记主要应用于鉴定刚竹属Phyllostachys、竹属Bambusa和箭竹属Fargesia的种和品种间的差异,以及品种保护。Loh等运用AFLP技术对竹子的遗传变异和种的相互关系作了有益的尝试。他们利用8个引物组合对15个竹种进行AFLP分析,根据AFLP产生的特异性条带成功区分了不同的竹种、鉴别了特殊竹种的基因型。Suyama等使用3对选择性引物对日本矮竹Sasasenanensis的51个叶片样本进行AFLP研究,每个样本检测到135～166条指纹,在24～83条不同的片断中有22条片断可用作指纹,鉴定出22个无性系等。Isagi等通过AFLP技术研究了刚竹属竹子Phyllostachyspubescens(Mazel)Ohwi的无性结构和开花特点,分析表明不同的遗传起源具有不同的开花时间。2.4利用现代生物学技术进行研究ZhaoX.,KochertG.将水稻微卫星(GGC)n应用到竹子遗传图谱研究上,李淑娴等将水稻微卫星引物应用到竹子分子系统的研究上,结果表明与传统的分类结果不同,巴山木竹属作为1个单独的属是成立的,并从不同的层面对青篱竹属相关属及属下一些竹种的关系提供了新的研究结果,为利用现代分子生物学技术对广义青篱竹属的系统学研究提供了借鉴。利用特定引物的PCR也被用于竹子的VNTR研究中,其中利用微卫星(GGC)n作为扩增引物,这些引物在Arundinariaamabilis、Phyllostachysrubromarginata和一种未确认的Bambusa等3竹种的基因组相同区域上能进行扩增,证明VNTR是竹子中非常灵敏的分子标记。这些工作对开展竹子的分子生物学研究提供了新的思路和方法。3生物技术的遗传改良和遗传改良3.1竹子组培中愈伤组织诱导建立的技术体系竹子组培是竹子育种的一个重要途径。研究人员对20余属70多个竹种开展了组织培养研究,阐明了外植体、基因型、激素种类、浓度和不同培养基成分对竹子组培中愈伤组织诱导形成、植株再生以及诱导生根效率的影响,并建立了成熟的组织培养技术体系,为竹子育种工作奠定了基础[48～50]。如前所述,遗传育种分子标记作为一种新型的遗传标记和重要的育种工具,在竹子品种鉴定、分类、分子遗传学基础、遗传变异等方面得到了不同程度的应用。3.2丛生竹类基因突变育种卓仁英、刘晓光等对影响麻竹转基因过程中的几个关键性因素进行了研究,其中卡那霉素和潮霉素都可以用于麻竹抗性愈伤组织筛选,初步建立了麻竹转基因技术体系,为丛生竹类转基因育种奠定了基础。俄罗斯形态遗传学研究所的专家利用转基因技术,培育出横截面为方形的竹子。用这种竹子砌筑的墙壁能像空心砖墙壁一样,提高房屋的保温隔热性能。科研人员从蜡菊的细胞中分离出塑造蜡菊秆形的基因,将其转入拟南芥细胞中。经过实验改进,研究者培育出方秆拟南芥。此后,将方秆拟南芥的秆形塑造基因和伞形科植物——大型白芷的光合作用基因导入竹子细胞中,并最终在伏尔加河下游地区培植出方秆竹子。4基因分离和鉴定4.1dimads18竹子开花是一个很复杂的过程。Isagi等研究了开花特点与无性系的关系。田波等从竹类植物麻竹Dendrocalamuslatiflorus幼穗中克隆到一个含完整编码区及3位端非翻译区的cDNA,命名为DIMADS18。该cDNA全长1039bp,编码区共编码249个氨基酸,具有典型的植物MADS盒基因结构。序列相似性分析结果表明,DIMADS18属于AGL6亚家族,其氨基酸序列与水稻Oryzasatival的MADS盒基因osMADS6同源性最高,序列一致性为88%,与拟南芥Arabidopsisthaliana的AGL6一致性为59%。DIMADS18在拟南芥中异位表达,转基因拟南芥表现出叶卷曲、植株矮小、开花时间提前、花聚生于花序顶端等性状,表明DIMADS18很可能参与麻竹开花时间的调控。他们采用RACE方法从麻竹中分离到16个MADS-box基因cDNA全长,在EMBL库中的登录号为:599750～599765。4.2生物酶基因检测Matsui研究了谷氨酸合成酶(glutaminsynthetase)活性变化与Moso竹笋基因表达情况,并研究了储藏期pBA-PAL酶的活性变化和Moso竹笋pBA-PAL、竹子PAL基因分子克隆和基因表达情况。他们还研究了BA-ACS、ACC合成酶和BA-ACO(1-aminocyclopropane-1-carboxylateoxidase)基因。竹类植物在EMBL或NCBI数据库中登录核酸序列有毛竹PhyllostachysedulisACCOxidase,rbcL(Chloroplastribulosebisphosphate)基因;毛竹的完整的BA-ACOmRNA全序列1375碱基,BA-ACS的ACC的cDNA全序列及BA-AC、pBA-PAL和pBA-GS部分mRNA序列。1个绿竹BambusaoldhamiiBoSUS1部分mRNA序列和3个BoSUS1蔗糖mRNA全序列合成酶的mRNA全序列。还有酸竹属Acidosasa、青篱竹属Arundinaria、流苏香竹Chimonocalamusfimbriatus等竹种的颗粒结合型淀粉合成酶granule-boundstarchsynthase,GBSSGBBS基因,即Waxy基因的部分序列.竹属Bambusa磷酸-蔗糖合成酶基因、PAL1基因几丁质酶的mRNA的cDNA全序列。矢竹Pseudosasajaponica、毛竹、岗姬竹Shibataeakumasaca5.8SrRNA基因的cDNA全序列。因篇幅关系其余基因未列出。5糖体dna内转录间隔区研究在植物系统发育研究过程中,通常采用的基因位点主要有叶绿体基因组的16SrRNA,23SrRNA,psbA,rbcL,rpoC2及matK基因等,同时叶绿体基因组的内含子(Intron)区和基因间隔区(Intergenicspacers,IGS)比编码区存在更多的变异和利用核糖体DNA内转录间隔区(InternalTranscribedSpacers,ITS)序列进行植物系统发育研究也有较广泛的应用。Zhang等禾本科rpl16内含子序列中作用。Clark等对草本植物、竹子与禾本科的几种植物进行比较,发现了2个重要的竹种群:温带和热带竹种群,且热带竹种群又进一步被分成古代竹种和近代热带竹种。诸葛强等研究了篱竹属核糖体DNAITS序列及亲缘关系研究:利用PCR扩增产物直接测序的方法分析广义青篱竹属中有关争议类群的代表种或模式种(毛竹为外类群)等18种竹种的核糖体DNA内转录间隔区ITS序列。茶秆竹与仙居苦竹关系非常密切,茶秆竹可归隶到青篱竹属中;翠竹和菲白竹关系密切,且与苦竹类竹种分为两个分支。Guo从GBSSI基因和ITS核糖体DNA内转录间隔区序列研究了筱竹属类群,利用ITS核糖体DNA内转录间隔区序列研究了禾本科、竹亚科及