乌梅白凤丸对肾虚血亏大鼠子宫内膜修复影响及作用机制研究

乌梅白凤丸对肾虚血亏大鼠子宫内膜修复影响及作用机制研究

乌凤丸是一种众所周知、疗效良好的妇科药物。这是由明代著名的中医龚廷贤创造的。这本书是在《寿世宝元》一书中出版的。具有补气养血、调经止带、阴阳双补的作用,用于治疗气血两虚,身体瘦弱,腰膝酸软,月经不调,崩漏带下等多种病证,临床运用范围非常广泛。本实验通过制备肾虚血亏月经不调大鼠模型,探讨乌鸡白凤丸对大鼠子宫内膜修复的影响及作用机制,现将结果报道如下。1材料和方法1.1材料表面1.1.1材料和试剂盒碘[125I]孕酮(progesterone)放射免疫分析药盒、雌二醇(estrogen)放射免疫分析药盒均由北京北方生物技术研究所提供,批号分别为20120520,20120620;转化生长因子(transforminggrowthfactor-β1,TGFβ1)试剂盒由北京博奥森生物技术有限公司提供,批号:BA0290。PG802—S型电子天平(梅特勒-托力公司,德国);MAIS医学图像分析系统(北航公司,中国);GM-1800恒温冰冻切片机(sendon,英国);MOTICB5双目生物显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司,中国)。1.1.2江西半边天合成组乌鸡白凤丸购自湖南中医药大学第一附属医院,江西半边天药业生产,生产批号120704;羟基脲片购自湖南中药大学第一附属医院,北京嘉林药业生产,生产批号120301。1.1.3体质量及密度规划SD雌性大鼠,清洁级,55只,10月龄,体质量250~280g;由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,许可证号为SCXK(湘)2011-0003。1.2实验方法1.2.1肾血亏模型检测先用75%的酒精棉球擦洗鼠尾,再用干棉球擦干,剪去大鼠尾端0.25~0.30cm,每隔1d放尾血10滴左右,并控制大鼠每天饲料量,通过饥饿(正常大鼠1d摄入普通饲料量在15~20g,模型则给予9g)来加速模型的建立。同时,灌服羟基脲450mg/(kg·d),连续2周。首次放血前采集血液测定血红蛋白及红细胞数,放血2周后,再次采集血液测定血红蛋白及红细胞数。肾虚血亏模型大鼠会出现体质量下降,精神萎靡,不活跃等症状,并有皮毛蓬松脱毛现象。本次实验中,与造模前相较,造模后大鼠体质量明显下降(P<0.01),血红蛋白水平及红细胞计数均明显下降(P<0.01)。连续阴道上皮细胞涂片,观察阴道上皮细胞角质化情况,以阴道上皮细胞角质化无明显周期性变化者视为大鼠月经周期紊乱,提示肾虚血亏月经不调大鼠造模成功。见表1。1.2.2灌服鸡白凤丸将造模后大鼠随机分组,模型组11只,乌鸡白凤丸低剂量组11只,乌鸡白凤丸中剂量组11只,乌鸡白凤丸高剂量组10只,另选取雌性SD大鼠11只空白对照组。低剂量组灌服乌鸡白凤丸溶液(0.20g/kg),中剂量组灌服乌鸡白凤丸溶液(0.40g/kg),高剂量组灌服乌鸡白凤丸溶液(0.80g/kg),分别相当于成人临床等效剂量的1、2、4倍;模型组、空白对照组灌服同等容积的蒸馏水,连续4周。1.2.3指标检测1.2.3.1.血清二醇和妊娠酮水平的测定在末次给药后,禁食24h,取血检测大鼠血清雌二醇、孕酮水平。采用放射免疫法检测,按试剂盒说明操作检测。1.2.3.2.大鼠子宫组织的形态变化取大鼠子宫组织,用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,常规制备组织切片,HE染色后,在光学显微镜下观察子宫形态学变化。1.2.3.免疫组化检测实验步骤:(1)取子宫组织4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,制备4μm组织切片。载玻片经防脱片剂处理(APES);(2)切片常规脱蜡入水;(3)蒸馏水加H2O2至0.3%,室温30min以灭活内源性酶,蒸馏水洗涤;(4)滴加5%BSA封闭液,室温20min。甩去多余液体,不洗;(5)分别滴加兔抗鼠TGFβ1抗体,37℃120min。0.01mol/LPBS洗3min×3次;(6)TGFβ1的标本滴加生物素标记山羊抗大鼠IgG抗体。37℃20min。0.01mol/LPBS洗3min×3次;(7)滴加试剂SABC,37℃20min。0.01mol/LPBS洗5min×4次;(8)DAB显色:使用DAB显色试剂盒(批号k125918D)。取1mL蒸馏水,加试剂盒中A、B、C试剂各1滴,混匀后加至切片。室温显色,镜下控制反应时间,一般5至20min。蒸馏水洗涤;(9)苏木素轻度复染。脱水透明,封片,显微镜观察;(10)用MAIS医学图像分析系统计算。每张切片随机取5个视野,在400倍视野下测光密度值,取其均值作为该鼠的平均光密度值。1.2.4afs所有计量资料采用SPSS17.0统计软件进行处理,以ue0af±s表示。组间比较,符合正态性者,用单因素方差分析,两两比较方差齐者采用LSD法,方差不齐时,用秩和检验。2结果2.1水平增重p>0.0与空白组比较,模型组血清雌二醇水平降低(P<0.01),孕酮水平增高(P<0.01);与模型组比较,乌鸡白凤丸高剂量组血清雌二醇水平增高(P<0.05),中、低剂量组亦有升高的趋势;乌鸡白凤丸各剂量组孕酮水平有下降的趋势,未见明显的统计学差异。见表2。2.2不同剂量hs-白凤丸对大鼠精子内皮厚度的影响,见表1空白组大鼠子宫壁各层结构清晰,子宫内膜完整,无空泡样改变,子宫腔管径较粗,内膜腺体丰富,腺体由单层柱状上皮构成,无明显增生。模型组子宫内膜变薄,有空泡样改变,腔管径较狭窄,体积变小,内膜腺体管腔扩张,腺上皮变薄,部分见空泡样改变;肌层变薄,可见少量炎症细胞浸润。乌鸡白凤丸低剂量组大鼠子宫内膜厚度较模型组有所增加,腔管径稍扩大,腺体管腔亦扩张,腺体上皮变薄,腺体上皮核分裂较多,呈增生状态。乌鸡白凤丸中剂量组和高剂量组子宫壁各层结构清晰,子宫内膜比较完整,单层柱状上皮较模型组无明显增生;各层细胞未见变性及坏死;内膜腺体管腔扩张及腺上皮变薄现象较模型组有减轻趋势。见图1。2.3模型1:高剂量对莲子平台内皮tgf1蛋白表达的影响与空白组比较,模型组子宫内膜TGFβ1蛋白表达减少(P<0.01);与模型组比较,高剂量组子宫内膜TGFβ1蛋白表达增加(P<0.05)。见图2,表3。3鸡白凤丸对平台大鼠精子内皮tgf1蛋白表达的影响中医学认为,月经后期和月经过少均属“月经不调”范畴。有学者对功能失调性子宫出血患者子宫内膜厚度研究发现,子宫内膜厚度小于0.5cm时,其中医症状表现多为虚证,其中,肾虚型子宫内膜最薄,血虚型次之,血瘀型第三,痰湿型第四。月经不调多因肾虚血亏,冲任不充,血海不能按时满溢而经迟或量少。治疗当以补肾养血,益气调经为主。乌鸡白凤丸以乌鸡调补气血,滋阴养肾为主药,配鹿角胶温补肾阳,益精强骨。除大量补肾之品外,尚有人参、黄芪、山药、甘草等补气健脾,当归、川芎、丹参活血化瘀。由此可见,乌鸡白凤丸是以补肾为主,兼有益气健脾、活血之功,是治疗肾虚血亏月经不调的要方,临床运用取得良好的疗效。正常的月经周期中,子宫内膜雌激素受体的量呈周期性变化,雌孕激素通过与子宫内膜细胞中特异的激素受体结合来调节月经周期。研究表明,在其他细胞因子的协同作用下,TGFβ1能够调节子宫内膜功能,维持子宫内膜组织内环境的稳定;能显著提高胶原、纤黏连蛋白纤维表达及细胞与基质黏附,促进内皮细胞黏附具有一定作用;可使内膜基质细胞生长分化,在低浓度时可促进上皮细胞DNA的合成;可以上调MMPs的表达,促进细胞外基质黏附蛋白和糖蛋白等成分的聚集,有利于细胞的转移及黏附,刺激多种血管生成因子的产生,促进新生血管形成。既往研究表明,乌鸡白凤丸具有兴奋骨髓合成正铁血红素,使多能干细胞向红系分化,刺激红细胞的生成,具有养血作用;乌鸡白凤丸与己烯雌酚具有相似的作用效果,可能通过兴奋肾上腺皮质而发挥作用;乌鸡白凤口服液能使雄激素致不孕大鼠模型子宫内膜增厚,腺体数目增多,肌层增厚,其作用机制可能与子宫内膜及肌层TGFβ1蛋白表达有关;乌鸡白凤丸有雌激素样作用,具有促进子宫内膜修复,腺体数目增多,肌层增厚,能够调节子宫内膜分泌机能不足的现象。本实验研究发现,采用放血、饥饿加灌服羟基脲制备肾虚血亏月经不调大鼠模型,模型大鼠出现体质量下降,精神萎靡,不活跃等症状,血红蛋白水平及红细胞计数均明显下降,阴道上皮细胞角质化无明显周期性变化,说明模型制备成功。与空白组比较,模型组大鼠血清雌二醇水平较低,孕酮水平