柱前衍生化rp-hplc法测定全蝎中16种氨基酸的含量

柱前衍生化rp-hplc法测定全蝎中16种氨基酸的含量

蝎子的所有药物都记录在蜀草本植物中。“开宝草本植物”被称为“风疹、中风、半身不稳、口眼歪、语言障碍、手脚痉挛”。《中华人民共和国药典》2010年版一部收载的全蝎为钳蝎科动物东亚钳蝎ButhusmartensiiKar-sch的干燥体,春末至秋初捕捉,除去泥沙,置沸水或沸盐水中,煮至全身僵硬,捞出,置通风处阴干［1］。全蝎的主要有效成分为蛋白质与核酸［2］,氨基酸作为蛋白质的基本结构单位,其含量及分布规律对全蝎的药理活性有重要意义［3］。目前的药效实验显示,全蝎药材对中枢神经、免疫系统、心血管系统及肿瘤细胞的作用都与全蝎中甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等的分布相关［4］。本研究采用异硫氰酸苯酯(PITC)为衍生试剂,建立了中药全蝎中16种氨基酸的RP-HPLC测定方法。所建立的条件方法稳定性高、操作简单、准确可靠,具有较高的灵敏度,可用于全蝎中水解氨基酸的含量测定。材料表面1分析方法及aglent反应AgilentHPLC1100系统(四元泵、真空在线脱气机、二极管阵列检测器、AgilentChemStation工作站,美国Agilent公司)。SatoriousBT25S型电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)。2对照品的制备全蝎药材分别购买于上海、安徽等地,由上海中医药大学崔亚君副教授鉴定为东亚钳蝎ButhusmartensiiKarsch的干燥体,样品来源见表1。16种氨基酸对照品:L-天冬氨酸(Asp,批号:110103)、L-谷氨酸(Glu,批号:110109)、L-丝氨酸(Ser,批号:120116)、L-甘氨酸(Gly,批号:120301)、L-组氨酸(His,批号:120112)、L-精氨酸(Arg,批号:101201)、L-苏氨酸(Thr,批号:120113)、L-丙氨酸(Ala,批号:120117)、L-脯氨酸(Pro,批号:100311)、L-酪氨酸(Tyr,批号:120201)、L-缬氨酸(Val,批号:120113)、L-蛋氨酸(Met,批号:110125)、L-异亮氨酸(Ile,批号:110801)、L-亮氨酸(Leu,批号:120117)、L-苯丙氨酸(Phe,批号:090712)、L-赖氨酸(Lys,批号:100423),以上对照品均购买自上海友思生物技术有限公司,纯度≥98%。异硫氰酸苯酯(PITC,AlphaAesar公司,纯度标示量为97.0%);乙腈(色谱纯,美国Fisher公司);醋酸钠、三乙胺、盐酸、正己烷、冰醋酸均为分析纯(国药集团上海公司);水为Milli-Q纯水。方法和结果1u3000-4-甲基-5-腈溶液流动相的制备UltimatePrimeC18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱;流动相A为0.1mol·L－1醋酸钠溶液(无水醋酸钠8.2g溶于900mL纯化水,用冰醋酸调pH至6.5,加水至1000mL)-乙腈(93∶7);流动相B为乙腈-水(8∶2);梯度洗脱:0~14min,0%~13%B;14~15min,13%~18%B;15~30min,18%~34%B;30~31min,34%~100%B;31~38min,100%B;38~38.1min,100%~0%B;38.1~45min,0%B);流速为1.0mL·min－1;柱温为40℃;进样量为5μL;检测波长为254nm。2混合对照品储备溶液精密称取16种氨基酸对照品于50mL量瓶中,用0.1mol·L－1盐酸溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,配制成混合对照品储备溶液,备用。3苯酚水解苯酚全蝎干燥样品打粉后过80目筛,取100mg,精密称定,置安瓿底部,加6mol·L－1盐酸5mL,滴入5滴苯酚,通氮气15min,迅速在喷灯上封口,置于110℃烘箱内水解24h,取出放冷至室温,精密吸取水解液1.00mL,置于小蒸发皿中水浴蒸干,挥去HCl气体,用0.1mol·L－1盐酸溶液5mL,分3次溶解洗涤并转移至10mL量瓶,定容。4白色溶液的制备以0.1mol·L－1盐酸溶液作为空白溶液。5微孔滤膜的制备精密吸取混合对照品溶液、样品溶液和空白溶液各1.00mL于10mL离心管内,精密加入0.1mol·L－1PITC乙腈溶液和1mol·L－1三乙胺乙腈溶液各0.50mL,混匀后室温放置1h,加正己烷4mL,涡旋1min,放置10min,取下层溶液过微孔滤膜(0.45μm),备用。6测定结果及方差分析6.1系统适用性取混合空白溶液、对照品溶液及供试品溶液各5μL,按照上述色谱条件测定16种氨基酸衍生物各峰能达到较好地分离,分离度均大于1.5,除Asp和Glu理论塔板数分别为5283和5104外,其余各氨基酸理论塔板数均大于3×104。高效液相色谱图见图1。6.2线性关系考察精密移取“2”项下对照品溶液0.25,0.50,1.00,2.00,4.00,8.00,10.00,12.50mL于25mL量瓶中,用0.1mol·L－1盐酸稀释至刻度,摇匀,分别标示为1~8,按“5”项下方法进行衍生化,按“1”项色谱条件测定峰面积,记录色谱图。以氨基酸对照品峰面积(y)对质量浓度(x,μg·mL－1)绘制工作曲线,计算回归方程。结果见表2。6.3精密度考察精密量取6号对照品溶液,按确定的色谱条件,连续进样6次,测定峰面积,计算16种氨基酸的精密度,RSD值均小于3.0%,说明该仪器精密度良好。6.4稳定性考察取3号样品的衍生化溶液,按上述色谱条件分别于0,4,8,12,24,36h进样,测定峰面积,稳定性考察结果显示,除Ser,His和Met这3种氨基酸RSD分别为3.6%,3.7%和4.0%外,其余13种氨基酸RSD值均小于3.0%。6.5重复性考察取3号样品6份,每份约100mg,精密称定,按“3”和“5”项下方法制备供试品溶液并衍生化,依上述色谱条件测定含量,除Gly和Val的RSD值分别为3.3%和3.0%外,其余氨基酸的RSD值均小于3.0%。6.6加样回收率精密称取3号样品9份于安瓿内,每份约50mg,平行分为3组,每组分别加入氨基酸对照品溶液2,2.5,3mL和3,2.5,2mL的浓盐酸溶液,滴入5滴苯酚。按“3”和“5”项下方法制备供试品溶液并衍生化,计算16种氨基酸的平均回收率(n=9)及RSD值,结果见表3。6.7样品含量测定取全蝎样品10个批次,按“3”和“5”项下方法制备供试品溶液并衍生化,测量16种氨基酸含量(mg·g－1),结果见表4。讨论1衍生化衍生物用于氨基酸分析技术早期的氨基酸分析是通过离子交换树脂分离,再进行柱后衍生化反应,以紫外检测器检测,但分析时间长,操作复杂,灵敏度低,而氨基酸分析仪测定专一、准确,但存在价格昂贵,分析时间长,且仪器功能单一,限制了氨基酸分析技术的广泛应用。近年来,衍生色谱技术开始应用于氨基酸的测定。异硫氰酸苯酯(PITC)、邻苯二甲醛(OPA)、2,4-二硝基氟苯(FDNB)和氯甲酸芴甲酯(FMOC)等柱前衍生化高效液相色谱法通常无需考虑衍生反应的动力学因素,衍生化试剂、反应条件和反应时间的选择不受色谱系统的限制,不需附加仪器设备,已有逐渐取代氨基酸自动分析仪的趋势,其中异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生法被列为首选［5］,因为此衍生方法反应速度快,产物单一、稳定,与一级二级氨基酸均反应,与紫外检测器结合也可提供较高的灵敏度。故本文采用PITC法进行柱前衍生。2流动相氨基酸检测参照文献[6-7]的流动相洗脱梯度,选取适当浓度的标准溶液与3号样品进行测试,调整流动相的洗脱梯度,在保证分离度的基础上,在45min内完成了16种氨基酸检测。3全蟹水解液中半胱氨酸含量色氨酸的测定需要碱水解条件［7］,无法与其他氨基酸同时测量;酸水解时半胱氨酸易转化为胱氨酸［8］,而在预试时发现全蝎水解液中半胱氨酸含量极低,几乎未检出,本研究未做测定。蛋白质的水解条件较为激烈,某些不稳定氨基酸(Ser,Thr,Met)会出现不同程度的降解［6］,为防止和减缓部分不稳定氨基酸的降解,水解前在样品中滴入几滴苯酚,也可有效帮助样品被盐酸溶液润湿,使水解充分。4在特殊温度下水解对安的影响参照文献[6-7]的水解条件,分别比较了在150℃烘箱中水解1h和在110℃烘箱中水解24h,由于150℃的较高温度,对安瓿的耐高温和耐压要求较高,本实验采用的安瓿在此温度下炸开,影响了水解的进行,因而采用在110℃烘箱中进行水解24h,以保证水解的完全。5氨基酸检测结果在考察线性关系时配制8种浓度标准溶液,Asp和Glu两种氨基酸的标准曲线排除最高浓度两点后,线性相关系数可分别达到1.0000和0.9999,样品含量测定仍在标准曲线线性范围内(Asp:3.292~105.3μg·mL－1,Glu:3.328~106.5μg·mL－1),其余14种氨基酸的标准曲线均包含了8种浓度标准溶液且线性良好。检测结果表明,不同产地全蝎氨基酸总含量差别较大,可能因为全蝎作为珍贵虫类药材