正交设计优化姜酚提取工艺及高效液相色谱-二极管阵列检测法的含量测定

正交设计优化姜酚提取工艺及高效液相色谱-二极管阵列检测法的含量测定

根据现代药理学研究，姜具有清热、镇痛、抗炎、抗心力衰竭、抗菌、排泄、促进胆混合、抗血小板聚集等药理活性。姜中的化学成分主要包括挥发油、二苯庚烷类和姜辣素类化合物,其中二苯庚烷类和姜辣素化合物为不挥发性成分。姜酚是姜中辣味成分的主要组分之一,具有强心、降压、降血脂、降血糖、抗血小板、抗氧化、抗肿瘤、抗炎止痛等广泛的药理作用。中国药典2005年版只规定了挥发油测定作为干姜的含量测定方法,无法体现干姜中多种化学成分的组成情况,且仅以挥发油的含量评价干姜质量也具有非常明显的片面性,忽视了不挥发性成分的作用,难以有效评价和控制干姜的质量。本研究以6-姜酚为指标成分,通过正交设计优化提取干姜中不挥发性成分,为相关的质量控制研究提供方法和依据。1中药粉碎机和培养基Agilent1100HPLC-DAD高效液相色谱仪;METTLERAE240电子天平;DFT-200中药粉碎机;SK2200H超声仪。6-姜酚对照品购自上海同田生物技术有限公司,经HPLC面积归一化法检查,纯度均大于98.5%。干姜购自上海养和堂中药饮片有限公司,经鉴定为姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.根茎干燥的加工品。甲醇为色谱纯,余均为分析纯,水为去离子水。2方法和结果2.16-姜酚的含量测定2.1.1流动相、检测波长色谱柱:AgilentZORBAXSB-C18柱(4.6mm×150.0mm,5μm);流动相:甲醇-水(60∶40);检测波长:282nm;流速:1.0ml/min;柱温:25℃;进样量:10μl。2.1.2对照品储备液的制备精密称取6-姜酚对照品15.05mg,置10ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得(每1ml中含6-姜酚对照品1.505mg),作为对照品储备液。精密量取适量储备液分别加甲醇稀释,可得浓度为1.505、7.525、15.050、150.500、301.000μg/ml的系列对照品溶液,置于4℃冰箱保存。2.1.3超声活化法取干姜粉末约0.16g(过40目筛,40℃干燥至恒重),精密称定,置10ml容量瓶中,加甲醇9ml,浸泡40min,超声处理45min,放冷至室温,加甲醇至刻度,摇匀,0.45μm滤膜滤过,弃去初滤液,取续滤液,即得。2.1.4系统适应性研究以对照品溶液进样,根据色谱参数计算系统适应性。6-姜酚色谱峰的理论塔板数为6610,分离度为10.636,拖尾因子为0.981。2.1.5标准曲线的绘制将不同浓度的系列对照品溶液依次连续进样测定(n=3),以对照品溶液的浓度为横坐标(X),峰面积值为纵坐标(Y)绘制标准曲线,计算回归方程Y=4.067X-1.927(γ=0.9999),结果见图1。2.1.6方法的精密度分别取低、中、高3种浓度的对照品溶液,在1天之内连续进样3次,以及连续3天分别进样,检测峰面积,进行日内和日间精密度(RSD)考察,其峰面积的RSD分别为1.08%和1.30%,0.71%和1.28%,0.59%和1.04%。2.1.7样品溶液的制备精密称定干姜粉末0.16g,按照“2.1.3”项下方法制备样品溶液。分别在0、0.5、1、2、4、8、12、24h测定6-姜酚的含量,进行稳定性考察,其峰面积的RSD为0.43%。2.1.8方法的重复性精密称定干姜粉末6份各0.16g,分别按照“2.1.3”项下方法制备样品溶液,测定6-姜酚的含量,进行重复性考察,其峰面积的RSD为1.32%。2.1.9-姜酚最低检测条件将1.505μg/ml6-姜酚对照品溶液的峰高与空白溶剂进样的噪声进行比较,以信噪比3∶1计算6-姜酚能被检测出的最低浓度为0.2508μg/ml。2.1.1-姜酚最低检测条件的确定将1.505μg/ml6-姜酚对照品溶液的峰高与空白溶剂进样的噪音进行比较,以信噪比10∶1计算6-姜酚能被检测出的最低浓度为0.8361μg/ml。2.1.1加样回收率试验精密称定6-姜酚含量分别为0.62%的干姜粉末9份,各0.16g,分别精密加入6-姜酚对照品储备液0.54、0.68、0.82ml,按“2.1.3”项下方法制备样品溶液,测定6-姜酚的含量,考察加样回收率。结果分别为98.47%、100.78%、101.11%;RSD分别为0.89%、1.05%、1.89%。6-姜酚对照品和干姜HPLC-DAD含量测定色谱图见图2。2.26-姜酚提取优化2.2.1因素试验以6-姜酚的含量(Y)为评价指标,选择固液比例(A)、浸泡时间(B)和超声时间(C)3个因素进行干姜甲醇超声提取条件的优化,分别采用L9(34)正交试验表设计试验,因素和水平设置见表1。2.2.2提取6-姜酚取9份干姜粉末适量,精密称定,置10ml容量瓶中,按表1设计加甲醇适量,振摇混合后,进行相应的浸泡和超声处理,放冷至室温,用甲醇定容,摇匀,溶液经0.45μm滤膜滤过,弃去初滤液,取续滤液,测定6-姜酚的含量,结果见表1。2.2.3不同固液比例对6-姜酚含量的影响利用SPSS11.0统计软件对正交试验的数据进行方差分析,模型检验的F值为38.181,具有统计学意义(P<0.05)。浸泡时间(B)和超声时间(C)的F值分别为29.962和78.377,P值均<0.05,说明二者对6-姜酚含量的影响有统计学意义,而固液比例(A)对6-姜酚含量的影响无统计学意义(P>0.05)。对6-姜酚含量的影响次序依次为超声时间(C)>浸泡时间(B)>固液比例(A)。结合实际情况,确定最优的制备条件为:加60倍量甲醇,浸泡40min,再超声处理45min。2.2.4重现性的测定按照上述确定的最优条件进行制备,重复3次,6-姜酚超声提取的平均含量为0.62%,RSD为0.94%,说明正交设计所得制备条件的重现性良好、稳定性可靠。3流动相体系的选择6-姜酚是由芳香环和烷基侧链共同组成的化合物,具有良好的紫外吸收,可在282nm处检测。另外,其烷基侧链较长导致脂溶性较大,适当增加流动相中甲醇的比例,在保证良好分离度的前提下,可以较快完成分离测定。比较甲醇-水和乙腈-水两种不同流动相体系对6-姜酚分离的影响,可以发现二者均可以满足分析测定的需要,取得良好的检测效果。从节约成本的角度考虑,确定选用甲醇-水体系用于6-姜酚的含量测定。6-姜酚在高温条