3种方法提取艾纳香叶挥发性成分的gc-ms分析

3种方法提取艾纳香叶挥发性成分的gc-ms分析

爱纳香（l.）d.是贵州罗甸县的一种地下药物。艾纳香叶和嫩枝可制取艾片(左旋龙脑)和艾纳香挥发油。艾纳香挥发油有独特香气,具有抗菌、消炎、消肿、止痛等作用,受到医疗美容和香精香料行业的亲睐。挥发油的传统提取方法为水蒸汽蒸馏法,郝小燕等,周欣等,杜萍等,Bhuiyan等都使用水蒸汽蒸馏法(steamdistillation,SD)制取艾纳香挥发油,并研究其组成,但是水蒸汽蒸馏耗时长,馏出水量大,萃取时消耗溶剂量大,操作繁琐。近几十年多种挥发油提取方法得到发展,同时蒸馏萃取法(simultaneousdistillationextraction,SDE)是水蒸汽蒸馏与溶剂萃取二合为一,用于提取挥发油可减少操作步骤,节省萃取溶剂,设备相对简单。顶空固相微萃取(headspacesolid-phasemicroextraction,HS-SPME)是一种集采样、萃取、浓缩、进样于一体的无溶剂样品预处理技术,具有处理时间短、不使用有机溶剂、真实反映样品中挥发性物质组成等优点,适用于艾纳香叶挥发性物质组成分析。本研究利用气质联用(GC-MS)技术分析SD和SDE提取的艾纳香叶油状挥发物,并分析HS-SPME提取的艾纳香叶挥发性物质组成,对三者的化学成分进行对比,为选择合适的艾纳香叶油状挥发物的提取方法提供参考。1材料和方法1.1gc/ms-ms气相色谱质谱条件艾纳香叶贵州艾源生态药业开发有限公司(样品采摘时间为2010年11月,产地贵州省罗甸县);所用试剂均为分析纯。Varian1200LGC/MS-MS气相色谱质谱联用仪美国Varian公司;DB-5弹性石英毛细管柱30m×0.25mm,0.25μm,美国Agilent公司;Supleco固相微萃取装置、75μmCAR/PDMS萃取头美国Supelco公司。1.2实验方法1.2.1挥发油的提取称取艾纳香叶粉碎物(60~80目)50.00g置于2000mL圆底烧瓶中,加入1000mL去离子水,电热套加热蒸馏,蒸馏过程中持续加入去离子水以补充馏出水,馏出液达到5000mL时停止蒸馏(耗时约10h),合并馏出液,用等体积石油醚(30~60℃)萃取1h,分液,加入无水硫酸钠干燥,以上操作重复3次(共使用原料约150g)。合并石油醚,水浴加热50℃回收石油醚,最终获得黄色挥发物4.4907g,得率为2.99%。将黄色挥发物与石油醚(30~60℃)按1∶5(g∶mL)配制成溶液,4℃存放24h进行重结晶,分出晶体,剩余物挥干石油醚,得到黄色油状挥发物质量1.4132g,得率为0.94%,用于GC-MS分析。以上实验平行3次。1.2.2挥发油的提取称取艾纳香叶粉碎物(60~80目)50.00g置于2000mL圆底烧瓶中,加入1000mL去离子水,电热套加热(与1.2.1项保持相同加热强度);在另一500mL烧瓶中加入200mL石油醚(30~60℃),水浴加热50℃,同时蒸馏萃取10h,取下石油醚相烧瓶,加无水硫酸钠干燥,以上操作重复3次(共使用原料约150g)。合并石油醚,水浴加热50℃回收石油醚,最终获得黄色挥发物4.62g,得率为3.08%。将黄色挥发物与石油醚(30~60℃)按1∶5(g∶mL)配制成溶液,4℃存放24h进行重结晶,分出晶体,剩余物挥干石油醚,得到黄色油状挥发物质量1.9067g,得率为1.27%,用于GC-MS分析。以上实验平行3次。1.2.3顶空固相萃取称取艾纳香叶5g置于样品瓶中,用聚四氟乙烯隔垫密封,使用CAR/PDMS萃取头进行萃取,环境温度45℃条件下顶空吸附30min。以上实验平行3次。1.3仪器条件1.3.1条件11.3.2传感器电路电子轰击离子源(EI),离子源温度200℃,电子能量70eV,发射电流34.6(A,检测器电压1000V,接口温度280℃,扫描质量范围35~500amu。1.3.3反匹配度分析采集到的质谱图同时与NIST和Wiley标准谱库对照,对组分定性,仅报道正反匹配度均大于800(最大值1000)的鉴定结果。用峰面积归一法计算各化学成分的相对含量。2结果与分析2.1gc-ms分析采用SD和SDE提取艾纳香叶油状挥发物,并用HS-SPME提取艾纳香叶挥发性物质,联合GC-MS技术对3个提取物样品进行分析,初步定性组分70种,其中有50种属于萜类化合物,萜烯种类最多,共30种,其他依次为萜醇16种、萜酮2种、萜醛1种、萜酯1种。图1为3个样品的GC-MS总离子图。通过谱库检索和分析,检出3个样品的成分组成见表1。3个样品的相对含量前5位的组分中,l-龙脑与樟脑香气相似,具有类似松木的气息,香气清凉尖刺,微带药香、胡椒香;(E)-石竹烯具有辛香、木香、柑橘香、樟脑香,温和的丁香香气;花椒素具有浓郁的花椒香气;桉叶醇具有桉树特有的气味和樟脑气息,并有清凉的草药味道;(+)-γ-古芸烯具有古芸香脂香气;(E)-罗勒烯具有草香、花香并伴有橙花油气息。从高相对含量组分的香气特征发现,3个样品的主体香气相似,以清凉的樟脑香和花椒香气为主,而油状挥发物的气味浓郁,这与作者的直观嗅觉结果一致。2.2sd油状挥发物相对组分含量分析SD提取油状挥发物和HS-SPME提取挥发性物质共同含有组分35种,在两样品的组分中相对含量分别为89.28%和86.67%,其中萜类32种。共有醇类13种,相对含量分别为57.51%和21.09%,萜醇12种;酮类2种,樟脑属萜酮;醚类1种,即百里氢醌二甲醚;酯类1种,即乙酸龙脑酯;烯类18种,全是萜烯,相对含量分别为19.06%和54.93%。以上数据表明,两者共有组分种类占总种类数近70%,相对含量之和占各自总量近90%,可充分代表自身的香气特征,两者主体香气特征相似。不同类别化合物在两样品中相对含量差异极大,主要表现在醇类、酮类和烯类物质,相对含量相差近3倍。SD油状挥发物中醇类物质相对含量普遍高于HS-SPME挥发性物质中2倍以上,而HS-SPME挥发性组分中烯类物质相对含量普遍高于SD油状挥发物中。从单一组分上看,SD油状挥发物中l-龙脑、樟脑和HS-SPME挥发性物质中(+)-γ-古芸烯、(E)-石竹烯的相对含量都超出对方近3倍,并且这几种组分都是高含量组分。SD油状挥发物独有组分15种(萜类7种),相对含量为3.17%,其中醇类4种(0.78%),酮类2种(0.24%),醛类2种(0.3%),酯类1种(0.44%),烯类2种(0.24%),苯环类1种(0.66%)、烷烃类1种(0.26%)和酸类2种(0.25%);HS-SPME挥发性物质中独有组分14种(萜类11种),相对含量为4.56%,其中醇类1种(0.28%),酮类2种(0.26%),烯类11种(4.02%)。以上数据表明,两者各自独有组分相对含量较低,除罗汉柏烯-13外都不足1%,SD油状挥发物独有组分主要是高沸点化合物,HS-SPME挥发性物质中独有组分主要是烯类化合物,易被氧化。由于SD提取过程蒸馏温度(100℃)远高于HS-SPME提取过程温度(45℃),因此低沸点、低含量、易氧化分解化合物不易保留,而高沸点化合物被收集得到。两者独有组分相对含量不高,对自身香气影响不大,可认为SD油状挥发物与HS-SPME提取的挥发性化合物组成相似。一般认为HS-SPME提取的挥发性化合物更接近原始样品的香气组成,因此可认为SD油状挥发物代表艾纳香原始香气。经作者本人嗅闻认为油状挥发物气味较浓郁,可认为油状挥发物浓缩了艾纳香叶香气成分。2.3油状挥发物组分SDE油状挥发物和HS-SPME挥发性物质共同含有组分18种,在SDE和HS-SPME提取组分中相对含量分别为88.21%和62.45%,其中萜类16种。共有醇类12种,相对含量分别为61.44%和20.78%,萜醇12种;酮类1种,即花椒素;醚类1种,即百里氢醌二甲醚;烯类4种,全是萜烯,相对含量分别为9.29%和31.81%。以上数据表明,两者共有组分相对含量之和相差大,不同类别化合物在两样品中相对含量差异极大,主要表现在醇类、酮类和烯类物质,相对含量相差近3倍。SDE油状挥发物中醇类物质相对含量普遍高于HS-SPME挥发性物质中近3倍,而HS-SPME挥发性物质中烯类物质相对含量普遍高于SDE油状挥发物中近3倍。从单一组分上看,SDE油状挥发物中l-龙脑、(-)-愈创木醇、10-表位-γ-桉叶醇、γ-桉叶醇、4,4-二甲基-四环[6.3.2.0(2,5).0(1,8)]十三碳-9-醇、β-桉叶醇、绿花白千层醇和花椒素的相对含量超出HS-SPME挥发性物质中2倍以上;HS-SPME挥发性物质中(E)-石竹烯、α-石竹烯和别香橙烯的相对含量都超出SDE油状挥发物中近5倍,两者间差异较大。SDE油状挥发物独有组分6种(萜类1种),相对含量为4.5%,其中酮类1种(1.37%),醛类1种(0.51%),酯类3种(2.26%),烯类1种(0.36%);HS-SPME挥发性物质中独有组分31种(萜类27种),相对含量为28.92%,其中醇类2种(0.59%),酮类3种(0.82%),酯类1种(0.36%),烯类25种(27.15%)。以上数据表明,两者独有组分相对含量差异巨大,SDE油状挥发物独有组分相对含量之和较小,主要是高沸点的酯类化合物,HS-SPME挥发性物质中独有组分相对含量之和较大,主要是低含量烯类化合物。由于SDE过程中蒸馏和萃取温度较SD过程还高,低沸点、低含量、易氧化、酯化化合物更不易保留,因此SDE油状挥发物中酯类物质较多。两者间共有组分与独有组分的化合物种类和相对含量差异较大,SDE油状挥发物并不能充分代表艾纳香挥发性成分,但是经作者嗅闻认为差异并不明显,只是油状挥发物气味较浓郁。2.4艾纳香叶挥发性成分有普通成分,有6种两油状挥发物共同含有组分17种,在SD和SDE提取油状挥发物中相对含量分别为79.38%和85.48%,其中萜类15种。共有醇类11种,相对含量分别为56.78%和58.71%,都属萜醇;酮类1种,即花椒素;醚类1种,即百里氢醌二甲醚;烯类4种,全是萜烯,相对含量分别为12.53%和9.29%。以上数据表明,两者共有组分几乎涵盖了各自相对含量超过1%的全部组分,相对含量之和占总量80%左右,足以代表自身的香气特征。两油状挥发物的组分种数相差巨大,SD油状挥发物组分总数比SDE多26个,SD油状挥发物独有组分33种(萜类23种),相对含量为13.7%,其中醇类6种(1.51%),酮类3种(2.68%),醛类2种(0.3%),酯类2种(0.64%),烯类16种(6.77%),苯环类1种(0.66%)、烷烃类1种(0.26%)和酸类2种(0.25%);SDE油状挥发物独有组分7种,相对含量为7.23%,其中醇类1种(2.73%),酮类1种(1.37%),醛类1种(0.51%),酯类3种(2.26%),烯类1种(0.36%)。SD油状挥发物中独有的醇类和烯类化合物达22种,大部分属于低沸点或低含量化合物,SDE油状挥发物中独有组分都是高沸点化合物。此结果可能是因为SDE过程中萃取温度(50℃)高于SD过程中萃取温度(<20℃),经过长时间运行,低沸点和易氧化化合物难以保留。两油状挥发物共有组分相对含量之和接近,不同类别组分的相对含量差值不大,独有组分种类差异大,但是相对含量低,因此可认为两油状挥发物的组分相似,经作者嗅闻认为两者气味相似。综上所述,艾纳香叶挥发性成分中主要为醇类和烯类物质,其中大部分都是萜类物质,樟脑香和花椒香为其主体香气。SD油状挥发物中所含组分比SDE油状挥发物中丰富,保留较多低沸点、低含量化合物,与HS-SPME提取挥发性成分相比,又多收得高沸点化合物。SDE油状挥发物组分种类少,含有高沸点化合物种类较多。由此认为,SD提取的油状挥发物更接近原料挥发性成分组成,SDE提取的油状挥发物组成与原料挥发性成分差异稍大,不适合提取低沸点化合物。而艾纳香叶中低沸点化合物含量低,因此认为SD和SDE油状挥发物组成差异不大。分析艾纳香挥发性成分时,HS-SPME更能反映艾纳香的香气组成,但是对高沸点化合物提取效果不佳;SDE提取的组分少,但是对高沸点化合物提取效果好;SD提取的组分接近原料的挥发性成分组成,但是耗时长,耗溶剂多,操作繁琐;综合考虑,HS-SPME和SDE并用可达到满意的分析效果。制取艾纳香油状挥发物时,HS-SPME不适用,只能用于检测;SD虽提取组分丰富,但是消耗大,成本高;SDE虽提取组分少,但是基本代表原料的挥发性成分,经作者初步感官评价差异不明显,而且此法用水和溶剂量都大大减少,过程简化,设备简单,成本降低,适合应用于大规模制取艾纳香油状挥发物。3艾纳香叶挥发性成分组成利用SD和SDE提取艾纳香叶油状挥发物,并利用HS-SPME提取艾纳香叶挥发性成分,再结合气质联用技术对其进行分析,初步定性出挥发性成分70种,以醇、烯类物质居多,且多为萜类物质。与HS-SPME提取挥发性成分相比,SD油状挥发物保留艾纳香叶挥发性组分较多,SDE油状挥发物中低沸点化合物少,由于艾纳香叶中低沸点化合物含量较低,所以两油状挥发物主要成分相似,其中相对含量最高的是l-龙脑。SDE与SD