上海交通大学微生物实验课件实验十一血清学试验

实验十一

凝集试验

（Agglutinationassay）

酶联免疫吸附试验

(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay,ELISA)实验要求掌握凝集试验的原理、方法，结果判定和凝集效价的判定。掌握ELISA的基本原理，操作步骤，和ELISA的应用。了解血清学试验在病原微生物学中的应用一、抗原的基本概念

抗原：凡能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，并能与抗体和致敏淋巴细胞发生特异性结合的物质。

抗原决定簇（抗原表位epitope）:抗原分子上的免疫活性区，负责和免疫活性细胞上的抗原受体和抗体相结合。有的抗原分子上可能只有一个抗原决定簇（抗生素等小分子），有的抗原分子上可能有多个抗原决定簇（如病毒、细菌等）。用病毒或细菌等抗原免疫动物机体后，机体所产生的抗体则为多克隆抗体，即通常所讲的抗血清。二、抗体的基本概念

机体在抗原物质的刺激下所形成一类与抗原特异性结合的血清活性成分为抗体（Antibody）。抗体的化学本质是免疫球蛋白。所有抗体的单体都由4条多肽链构成：两条重链和两条轻链。

轻链N端1/2和重链N端1/4的氨基酸组成和序列变化较大，称为可变区（variableregion,VL,VH）,肽链的其余部分变化不大，称为恒定区（constantregion,CH,CL）。

可变区是与抗原结合的区域，决定抗体的特异性。

ELISA的基本原理

酶标记抗体或抗原可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。在底物溶液中在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应（酶分子与抗体或抗原共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性）。颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。应用：抗原鉴定、疾病诊断、抗体效价检测、疫苗免疫效果评价等检测抗原检测抗体实验步骤１：所有试剂回升到室温２：标记好各自的反应孔（每组2人，每组4个孔）３：抗体包被，４℃过夜，ＰＢＳＴ洗涤（该步骤试剂盒已完成）４：每组第１-3孔各加5０µl样品稀释液，然后第一孔加提供的大肠杆菌菌液5０µl，然后递减稀释至第2孔，从第2孔取出50µl丢弃。第3孔不加其他物质，第4孔加50µl阳性标准对照物,２５℃作用30-60min．5：倒掉孔中液体，并在吸水纸上拍干，每孔立即加洗涤液ＰＢＳＴ溶液５０µl，室温静置２分钟，拍打干净，按上述方法再重复洗涤各孔3次。6：每孔加5０µl已稀释的酶标记物，２５℃作用30-60min7：洗涤3次，同步骤5洗涤．8：加显色试剂A5０µl,再加显色试剂B5０µl,25℃暗处作用１５分钟．9：每孔加反应终止液５０µl,特别注意安全，观察颜色变化.10:测定在４５０nm处测定吸光度值。所有的测试条都放回到板中统一测定以空白孔调零。

记录各孔的OD值，确定阴性和阳性值。