微生物发酵制药

第二章微生物发酵制药技术1整理课件发酵发酵制药发酵制药的根本过程第一节概述2整理课件概念：通过微生物培养而获得产物的过程种类：用产品说明，如青霉素发酵、维生素发酵初级代谢产物：在初级代谢过程中形成产物，包括各种小分子前体、单体和多糖、蛋白质、脂肪、核酸等，是生长所必须的，几乎所有生物初级代谢根本相同。氨基酸、核苷酸、有机酸。次级代谢产物：是比较复杂的化合物，不是细胞生长必需的，对生命有意义〔抗逆境条件〕。抗生物、毒素、色素。发酵3整理课件发酵罐发酵4整理课件立式卧式摇床发酵5整理课件静置发酵6整理课件利用制药微生物的生长繁殖，通过发酵、代谢合成药物，然后从中提取、精制纯化，获得药品的过程。发酵制药7整理课件发酵制药流程8整理课件发酵制药工艺9整理课件菌体生长与产物合成的三个阶段：发酵前期〔fermentationprophase)菌体生长期〔cellgrowthphase)发酵中期(fermentationmetphase)产物合成期〔productsynthesisphase)发酵后期〔fermentationanahase〕菌体自溶期〔cellautolysisphase)微生物发酵根本过程特征10整理课件从接种至菌体到达一定临界浓度的时间，包括延滞期、对数生长期和减速期。代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。pH变化：先升后降－以氨基酸为碳源，释放氨，后氨被利用。先降后升－以糖为碳源，释放出丙酮酸等有机酸，后被利用。发酵前期特征11整理课件以次级代谢产物或目标产物的生物合成为主的一段时间。菌体生长恒定就进入产物合成阶段。呼吸强度：无明显变化，菌体数目不增加。产物量：逐渐增加，生产速率加快，至最顶峰后合成能力衰退。对外界变化敏感:容易影响代谢过程，从而影响整个发酵过程。发酵中期特征12整理课件菌体衰老，细胞开始自溶的一段时间合成产物能力衰退，生产速率减慢氨基氮含量增加，pH上升发酵必须结束，否那么产物被破坏，菌体自溶给过滤和提取带来困难发酵后期特征13整理课件第二节制药微生物与产物的生物合成制药微生物的选择制药微生物的选育微生物菌种的保藏微生物代谢产物的生物合成微生物生物合成的调节14整理课件〔1〕所需培养基易得，价格低廉；〔2〕培养和发酵条件温和〔糖浓度、温度、pH、溶解氧、渗透压等〕〔3〕生长速度和反响速度较快，发酵周期短〔4〕单产高〔选择野生型、营养缺陷型或调节突变株〕〔5〕抗病毒能力强〔6〕菌种纯粹，不易变异退化，稳定性好〔7〕菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素〔包括抗生素、激素和毒素〕，保证平安一、制药微生物的选择15整理课件来源：大陆土壤、海洋水体样品的采集：表层土壤(0-10cm)，海洋〔0-100m〕预处理：根据别离目的和微生物的特性1〕温度2〕水分去除，3〕化学：SDS－酵母膏，CaCO3，NaOH处理，减少细菌，有利于放线菌别离；乙酸乙酯、氯仿、苯处理，除去真菌。4〕离心、膜别离。生产菌的自然别离16整理课件培养基：选择适宜的培养基，营养和pH，添加抑制剂如抗生素，制霉菌素等。别离方法：1〕稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲溶液2〕滤膜法：0.22－0.45um。细菌在膜上，放线菌菌丝可穿透，进入培养基。培养条件：放线菌25-30℃，32-37℃，45-50℃，7-14天至1月。17整理课件二、制药微生物菌种的选育1、选育的目的改善菌种的特性，使产量提高，改进质量、降低本钱、改革工艺、方便管理及综合利用等2、选育的方法：A、自然选育；B、诱变育种C、杂交育种18整理课件定义：不经过人工诱变处理，根据菌种的自然突变而进行的菌种筛选过程。应用：1〕菌种的纯化2〕菌株的复壮。2〕选育高产菌株自然选育19整理课件菌种别离纯化1。稀释涂布2。平板划线纯化20整理课件斜面传代21整理课件诱变育种定义：但凡利用诱变剂处理分散而均匀的微生物群体，促进其基因发生突变的育种技术。方法：1〕物理类：紫外线，快中子，激光，太空射线.2〕化学类：碱基类似物，嵌合剂，亚硝酸。3〕生物类：噬菌体。特点：快速、简单、效益大。缺点:定向性差。22整理课件出发菌种的选择：较高产，对诱变剂敏感诱变剂的使用：交叉使用多种，合理组合。中等剂量〔80％致死率〕选择压：施加一定的选择压，获得耐药菌株。措施：添加抗生素，提高前体浓度，增加产物浓度。诱变方案设计23整理课件诱变育种流程24整理课件1、诱变育种中需要考虑的假设干因素〔1〕选择适宜的出发菌株产量高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度广〔2〕复合诱变剂的使用单一诱变剂重复使用后突变的效果不好，可用复合诱变剂来扩大诱变幅度，提高诱变效果。〔3〕诱变剂量的选择致死率取决于诱变剂量，而致死率和诱变率之间有一定的关系。因此可以用致死剂量来作为选择适宜剂量的依据。但凡能增加变异的幅度又能促使变异向正变范围移动的剂量就是适宜剂量。〔4〕变异菌株的筛选25整理课件2、新诱变技术〔1〕低能离子束诱变：离子注入是20世纪80年代兴起的一种外表处理技术。这种相互作用过程大致分为能量沉积、动量传递、离子注入和电荷交换等四个原初反响过程，在10－19－10－13s中间时发生。荷能离子注入除具有Y射线能量沉积引起机体损伤的特征外，还具有动能交换产生的级联损伤，表现为遗传物质原子转移、重排或基因的缺失。还有慢化离子、移位原子和本底元素复合反响造成的化学损伤以及电荷交换引起的生物分子电子转移造成的损伤。离子注入生物学效应显示出一些不同于辐射生物学的特征，相当于物理和化学诱变两者相结合的复合诱变效应〔2〕激光辐射诱变和微波电磁辐射诱变26整理课件概念：不同基因型的品系或种属间，通过交配或体细胞融合等手段形成杂种，或者是通过转化和转导形成重组体，从中别离筛选出具有优良性状的新菌株。特点：有一定的定向性。种类：体细胞重组、接合、原生质体融合。杂交育种27整理课件通过生物学、化学或物理学的方法，使两个不同种类的体细胞融合在一起，从而产生具有两个亲本遗传性状的新细胞。原生质体融合28整理课件体细胞重组育种29整理课件结合育种30整理课件定向分子育种概念：在分子水平，体外模拟自然进化机制，是突变、重组、选择的重复循环。目的：获得有益突变，淘汰有害突变，使进化向有益方向开展。定向分子育种31整理课件防止菌株衰退的措施菌种退化：菌种的发酵能力降低、繁殖能力降低、发酵产品的得率降低.1、衰退的可能原因〔1〕、基因突变〔2〕、别离现象2、防止菌种衰退的方法

A、从菌种选育方面考虑；B、尽量减少传代次数C、创造良好的培养条件；D、利用不易衰退的细胞传代;E、采用有效的菌种保藏方法32整理课件3.菌种复壮方法①纯种别离法；②淘汰已衰退的个体③采用其它方法：诱变因素处理，再进行单菌落别离；选择适宜的培养基33整理课件原因：菌种经过屡次传代，会发生遗传变异，导致退化，从而丧失生产能力甚至菌株死亡。目的：保持菌种原有优良特性，延长生命时限，长期存活、不退化。原理：根据菌种的生物生理、生化特点，人工地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态，生长繁殖处于休眠状态。关键：保藏时首先要挑选优良纯种，最好是它们的休眠体〔孢子、芽孢等〕，其次是要创造一个最有利于休眠的环境，如低温、枯燥、缺氧和缺乏营养物质等，以到达降低其代谢活动，延长保存期的目的。三、微生物菌种的保藏34整理课件菌种保藏的方法斜面保藏法、矿物油保藏法、砂土保管保藏法、真空冷冻枯燥法、冷冻法、液态真空枯燥法、琼脂穿刺封口保藏法、曲法保藏、麦粒保藏法、无水硅胶保藏法。35整理课件〔1〕斜面保藏法：在4℃左右的冰箱保藏，每隔一定时间进行移植培养后再继续保藏，如此反复。优点：方法简单、存活率高，具有一定的保藏效果。缺点：菌种仍有一定的强度的代谢活动条件，保存时间不长〔1－6个月〕，传代多，菌种容易变异。适用菌种：细菌、酵母、防线菌、霉菌36整理课件〔2〕矿物油保藏法将生长好的斜面在无菌条件下倒入已灭菌的液体石蜡，油层高于斜面末端1cm，然后放于冰箱中保存。适用菌种：适用于除细菌外的其它菌种〔3〕砂土管保藏法利用土壤颗粒对微生物起保护作用，提高微生物的存活率。其包括砂土制备和真空抽干两步。适用菌种：产孢子的微生物，对于一些对枯燥敏感的细菌〔奈氏球菌、弧菌、假单胞杆菌〕以及酵母不适用。37整理课件〔4〕真空冷冻枯燥法先在菌悬液参加保护剂〔如：脱脂牛奶、血清等〕然后在较低温度下使成冻结状态，最后减压抽干。特点：它是菌种保藏中最有效的一种方法。保存期可达一年至数十年之久，并且存活率高，变异率低。但是手续麻烦，需要一定的设备。适用菌种：对于不长孢子或长的很少孢子的真菌保藏效果不佳。38整理课件〔5〕其他保藏方法冷冻法：分低温冷冻〔－20℃〕与超低温冷冻〔－196℃〕两种。适用于细菌、真菌、病毒等的保藏液态真空枯燥法：菌体在恒温液态条件下进行真空枯燥。适用于包括细菌、病毒，特别适用于冷冻枯燥保藏效果不佳的菌种。琼脂穿刺封口保藏法：适用于不产孢子细菌的保藏39整理课件曲法保藏：将麸皮与水按比例混合，灭菌后接入菌种，待孢子长成后即为成曲。将试管放入盛有氯化钙的枯燥器中，枯燥后低温保藏。适用于有大量孢子的霉菌和某些放线菌的保藏。麦粒保藏法：麦粒灭菌后接入菌液，培养有菌丝或孢子时，置通风、避光、枯燥处保藏。适用于一些放线菌、芽孢杆菌、酵母的保藏。无水硅胶保藏法：将细胞悬浮液和等体积的脱脂灭菌牛奶混匀，参加装有无水硅胶的试管中，然后将试管放于枯燥器内，室温或4℃保藏。对于细菌和真菌效果都较好。40整理课件国内外菌种保藏机构菌种是一个国家的重要资源，世界各国对菌种的保藏都极为重视。世界上有700多家菌菌种保藏机构，其中国际知识产权组织成认的法定的保藏机构仅有28家。41整理课件

1、我国的微生物菌种保藏机构1〕普通微生物菌种保藏管理中心〔CCGMC〕中科院微生物所，北京，中科院武汉病毒研究所2〕农业微生物菌种保藏管理中心〔ACCC〕中国农业科学院土壤肥料研究所，北京〔ISF〕3〕工业微生物菌种保藏管理中心〔CICC〕中国食品发酵工业科学研究院，北京，〔IFFI〕4〕医学微生物菌种保藏管理中心〔CMCC〕中国医学科学院皮肤病研究所，南京卫生部药品生物制品检定所，北京中国医学科学院病毒研究所5〕抗生素菌种保藏管理中心〔CACC〕中国医学科学学院抗生素研究所，北京四川抗生素工业研究所，成都华北制药厂抗生素研究所，石家庄6〕兽医微生物菌种保藏管理中心〔CVCC〕农业部兽医药品检察所，北京42整理课件2、国外主要的微生物菌种保藏机构1〕美国标准菌种收藏所〔ATCC〕2〕美国冷泉港研究所〔CSH〕3〕日本东京大学应用微生物研究所〔IAM〕4〕日本东京科研化学〔KCC〕5〕日本大阪发酵研究所〔IFO〕6〕英国国立标准菌种收藏所〔NCTC〕7〕美国国立卫生研究所〔NIH〕8〕美国农业部北方开发利用研究部〔NRRL〕43整理课件第三节发酵工艺条件确实定培养基及其制备灭菌操作发酵工艺条件确实定及主要控制参数44整理课件培养基〔medium)：供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物按微生物的主要类群来说，它们所需要的培养基成分也不同。

细菌：

牛肉膏蛋白胨培养基、LB

(Luria-Bertani)

放线菌：高氏一号培养基

真菌：

查氏合成培养基、PDA(Potato-Dextrose-Agar)

酵母菌；

麦芽汁培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量。一培养基45整理课件碳源氮源无机盐水生长因子前体与促进剂消泡剂培养基的成分46整理课件概念：

构成微生物细胞和代谢产物中碳的营养物质。作用：

为正常生理活动和过程提供能量来源，为细胞物质和代谢产物合成提供碳骨架。碳源47整理课件糖类：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜脂肪：豆油、棉籽油、猪油醇类：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白类：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖类、有机酸迟效碳源:酪蛋白水解产生的脂肪酸碳源的种类48整理课件概念：

构成微生物和代谢产物中氮素的营养物质作用:

为生长和代谢提供氮源种类：无机氮源、有机氮源氮源49整理课件几乎所有微生物都能利用有机氮源黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、尿素有机氮源50整理课件氨水、铵盐和硝酸盐等。铵盐比硝酸盐更快利用。工业应用：主要氮源和辅助氮源；调节pH值生理酸性物质：代谢后能产生酸性残留物质，如〔NH4)2SO4利用后，产生硫酸生理碱性物质：代谢后能产生碱性残留物质。如NaNO3利用后，产生氢氧化钠。无机氮源51整理课件概念：组成生理活性物质或具有生理调节作用的矿物质。作用方式：低浓度起促进作用，高难度起抑制作用种类：P、S、K、Na、Mg、Ca常常添加Fe、Zn、Cu、Mo、Co、Mn、Cl，一般不加无机盐与微量元素52整理课件水菌体细胞的主要成分营养传递的介质良好导体，调节细胞生长环境温度培养基的主要成分。53整理课件概念：维持微生物生长所必需的微量有机物，不起碳源和氮源作用。种类：维生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。天然成分中含有：一般无需添加。营养缺陷型菌株：必需添加。生长因子〔growthfactor〕54整理课件概念：参加到发酵培养基中的某些化合物，被直接结合到目标产物分子中，而自身的结构无多大变化。使用：添加前体是提高抗生素产量的重要措施屡次少量添加前体〔precurtsor〕55整理课件概念：促进产物生成的物质，但不是营养物，也不是前体的一类化合物。种类：氯化物有利于灰黄霉素、金霉素合成。外表活性剂吐温、清洗剂，脂溶性小分子化合物等，起诱导作用。促进剂〔accelerant〕56整理课件概念：降低泡沫的液膜强度和外表粘度，使泡沫破裂的化合物。种类：油脂类、酯类、硅油及聚氧乙烯－聚氧丙烯甘油醚。天然动植物油脂类、高分子化合物〔高碳醇脂肪酸和酯类、聚醚类、硅酮类〕作用：消除泡沫，防止逃液和染菌。消沫剂(defoamingagent)57整理课件按用途：选择性、鉴别性、富营养培养基等按物理性质:固体、半固体、液体培养基按化学组成：合成、半合成、天然培养基按发酵过程中所处位置和作用：斜面或平板固体、种子、发酵和补料培养基。培养基种类58整理课件概念：细菌和酵母的固体斜面或平板培养基，链霉素和丝状真菌的孢子培养基。制备：液体培养基添加1.0-2.0％琼脂粉。作用：提供菌体的生长繁殖，形成孢子固体培养基59整理课件单细胞培养基：营养丰富，满足菌体生长迅速，不能引起变异。孢子培养基：基质浓度较低，无机盐浓度适量，以利于孢子形成。营养不宜太丰富，否那么不易产生孢子。固体培养基－要求60整理课件概念：供孢子发芽和菌体生长繁殖，摇瓶和种子罐培养基，液体。作用：使种子扩大培养，增加细胞数目，生长形成强壮、健康和高活性的种子种子培养基〔seedmedium〕61整理课件培养基成分必需完全，营养丰富。用速效性、容易利用的碳、氮源和无机盐等物质，但浓度不宜高。种子培养基要与发酵培养基相适应，主要成分接近，不能差异太大。缩短发酵的延滞期。种子培养基－要求62整理课件概念：提供微生物生长、目标产物生成的生产用培养基作用：不仅要满足菌体的生长和繁殖，还要满足菌体合成目标产物，是发酵生产中最关键和最重要的培养基。发酵培养基的要求：

营养物质浓度和粘度适中，组成上丰富完整。不同菌种和不同产物，对培养基的要求差异很大，组成和配方需要优化。发酵培养基〔fermentationmedium)63整理课件概念：发酵过程中添加补充的培养基。作用：稳定工艺条件，延长发酵周期，提高目标产物产量。组成：各种必要的营养物质，碳源、氮源、前体制备：按单一成分配制，各自独立控制，或按一定比例制成复合补料培养基补料培养基64整理课件控制发酵培养基的质量65整理课件66整理课件67整理课件68整理课件培养基设计一般原那么69整理课件二、灭菌操作工艺70整理课件由于各种发酵过程所用的微生物菌种、培养基以及发酵的条件、产物的性质不同，染菌造成的危害程度也不同。不管是对于哪种发酵过程，一旦发生染菌，都会由于培养基中的营养成分被消耗或代谢产物被分解，严重影响到产物的生成，使发酵产品的产量大为降低。一〕、染菌对不同发酵过程的影响71整理课件1〕青霉素发酵过程：由于许多杂菌都能产生青霉素酶，因此不管染菌是发生在发酵前期、中期或后期，都会使青霉素迅速分解破坏，使目的产物得率降低，危害十分严重。2〕核苷或核苷酸发酵过程：由于所用的生产菌种是多种营养缺陷型微生物，其生长能力差，所需的培养基营养丰富，因此容易受到杂菌的污染，且染菌后，培养基中的营养成分迅速被消耗，严重抑制了生产菌的生长和代谢产物的生成。72整理课件3〕柠檬酸等有机酸发酵过程：一般在产酸后发酵液的pH值比较低，杂菌生长十分困难，在发酵中、后期不太会发生染菌，主要是要预防发酵前期染菌。4〕谷氨酸发酵：周期短，生产菌繁殖快，培养基不太丰富，一般较少污染杂菌，但噬菌体污染对谷氨酸发酵的影响较大。73整理课件种子培养期染菌染菌发生的不同时间对发酵的影响种子培养主要是使微生物细胞生长与繁殖，此时，微生物菌体浓度低，培养基营养十分丰富，比较容易染菌。假设将污染的种子带入发酵罐，那么危害极大，因此应严格控制种子染菌的发生。一旦发现种子受到杂菌的污染，应经灭菌后弃去，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养液中几乎没有抗生素〔产物〕或只有很少抗生素〔产物〕。因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。74整理课件发酵前期染菌在发酵前期，微生物菌体主要是处于生长、繁殖阶段，此时期代谢的产物很少，相对而言这个时期也容易染菌。染菌后的杂菌将迅速繁殖，与生产菌争夺培养基中的营养物质，严重干扰生产菌的正常生长、繁殖及产物的生成。原因：发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物〔抗生素〕或产生很少，抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。染菌补救措施：可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。75整理课件发酵中期染菌发酵中期染菌将会导致培养基中的营养物质大量消耗，并严重干扰生产菌的代谢，影响产物的生成。有的染菌后杂菌大量繁殖，产生酸性物质，使pH值下降，糖、氮等的消耗加速；菌体自溶，致使发酵液发粘，产生大量的泡沫，有时也会使发酵液发臭，代谢产物的积累减少或停止；有的染菌后会使已生成的产物被利用或破坏。措施降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一局部到染菌罐，抑制杂菌。76整理课件发酵后期染菌由于发酵后期培养基中的糖等营养物质已接近耗尽，且发酵的产物也已积累较多，如果染菌量不太多，对发酵影响相对来说就要小一些，可继续进行发酵。对发酵产物来说，发酵后期染菌对不同的产物的影响也是不同的，如抗生素、柠檬酸的发酵，染菌对产物的影响不大；肌苷酸、谷氨酸等地发酵，后期染菌也会影响产物的产量、提取和产品的质量。发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。77整理课件发酵过程污染杂菌是发酵工业的致命伤。造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失扰乱生产秩序，破坏生产方案。遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性。影响产品外观及内在质量78整理课件显微镜检查法二〕、染菌的检查和判断

用革兰氏染色法对样品进行涂片染色，显微镜下观察微生物的形态特征，根据生产菌和杂菌的特征进行区别、判断是否染色。如发现了与生产菌形态特征不一样的其他微生物存在，就可判断为发生了染菌。此法检查杂菌最为简单、直接，也是常用的方法之一。必要时还可进行芽孢染色或鞭毛染色。79整理课件肉汤培养法

通常用葡萄糖酚红肉汤作为培养基，将待检样品直接接入经完全灭菌后的肉汤培养基中，分别于37°C进行培养，随时观察微生物的生长情况，并取样进行镜检，判断是否染菌。肉汤培养法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，同时此法也用于噬菌体的检查。80整理课件平板培养

将待检样品在无菌平板上划线，分别于37°C、27°C进行培养，一般24h后即可进行镜检观察，检查是否染菌。有时为了提高平板培养法的灵敏度，也可以将需要检查的样品先置于37°C条件下培养6h，使杂菌迅速增值后再划线培养。无菌实验时，如果肉汤连续三次发生变色反响〔由红色变为黄色〕或产生浑浊，或平板培养连续三次发现有异常菌落的出现，即可判断为染菌。81整理课件抗生素发酵染菌原因分析〔日本工业技术院发酵研究所〕工程百分率%种子带菌或疑心种子带菌9.64接种时罐压跌零0.19培养基灭菌不透0.79总空气系统有菌19.96泡沫冒顶0.48夹套穿孔12.36盘管穿孔5.89接种管穿孔0.39阀门渗漏1.45搅拌轴密封渗漏2.09罐盖漏1.54其它设备渗漏10.13操作原因10.15原因不明24.9482整理课件三〕、噬菌体污染及其防治发酵过程中如果受噬菌体的侵染，一般发生溶菌，随之出现发酵缓慢或停止，而且受噬菌体感染后，往往会反复连续感染，使生产无法进行，甚至使种子全部丧失。83整理课件染噬菌体的检测在培养皿上倒入培养生产菌的培养基〔加琼脂〕作下层。同样的培养基中参加20％～30％培养好的种子液，再参加疑心染噬菌体的发酵液，摇均匀后，铺上层。培养过夜观察培养皿上是否出现噬菌斑。也可以在上层培养基中不加疑心染噬菌体的发酵液，而将发酵液直接点种在上层培养基外表，培养过夜，观察有无透明圈出现。84整理课件噬菌体的防治1、严格活菌体的排放，切断噬菌体的“根源〞２、做好环境卫生，消灭噬菌体和杂菌。３、认真进行发酵罐、补料系统的灭菌，严防噬菌体和杂菌进入种子罐和发酵罐。４、抑制罐内噬菌体的生长。噬菌体的防治是一项系统工程，具体归纳以下几点：85整理课件发酵罐中污染噬菌体后的抢救A、并罐法：利用噬菌体只能在处于生长繁殖期细胞中增值的特点，当发现发酵罐初期污染噬菌体时，将其他罐批发酵16~18h小时左右的发酵液，以等体积混合后分别发酵，利用其活力旺盛的种子，不进行加热灭菌，亦不需另行补种，便可正常发酵。B、选育抗噬菌体的菌种，或轮换使用菌种发现噬菌体后停搅拌、小通风，降低pH值，立即培养要轮换的菌种或抗性种子，培养好后接入发酵罐，并补加1/3正常量的玉米浆、磷盐和镁盐。86整理课件C、放罐重消法发现噬菌体后，放罐，调pH值，补加1/2正常量的玉米浆和1/3正常量的水解糖，适当降低温度重新灭菌，接入2%的种子，继续发酵。D、罐内灭噬菌体法：发现噬菌体停搅拌、小通风，将发酵液加热到70~80°C杀死噬菌体。冷却后，接种发酵。87整理课件

灭菌方法

化学灭菌88整理课件物理灭菌89整理课件培养基灭菌的操作方式90整理课件分批操作的灭菌过程冷却降温：依次关闭排气、进气阀。罐压低于空气压力后，通入无菌空气，夹套通冷却水降温通入蒸汽，加热升温：空气管、夹套通入蒸汽，升温至70℃，取样管、放料管通入蒸汽维持保温：120℃，罐压0.1MPa，排气。调节进气和排气量，维持30min。91整理课件连续灭菌操作92整理课件连续灭菌灭菌过程93整理课件连续灭菌的特点94整理课件三、微生物代谢产物的生物合成初级代谢产物：氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、脂类和碳水化合物等。主要满足微生物自身的生长繁殖。次级代谢产物：次级代谢产物是由微生物代谢产生的中间产物和初级代谢产物合成。95整理课件从代谢控制上看，初级代谢产物和次级代谢产物都受到核内遗传物质的控制。抗生素同时受到核外遗传物质质粒的控制。如在灰黄链霉菌、卡那霉素链霉菌等菌种中确认与抗生素生物合成有关的质粒存在。通常，如果菌种的染色体发生变异，多半是致死的，可质粒发生变异就不一定是致死的，而且可能产生新的次级代谢产物。96整理课件〔一〕初级代谢产物及其应用初级代谢产物用途乙醇含酒精饮料中的活性成分与石油混合后，可作为汽车燃料柠檬酸食品、化学工业中多种用途丙酮丁醇溶剂氨基酸药品、调味品核苷酸调味品多糖食品添加剂、提高油类回收率维生素食品添加剂、药品97整理课件〔二〕次级代谢产物的生源和生物合成生源：次级代谢产物分子中构建单位的来源。生物合成：各种构建单位在多种酶的作用下合成各种次级代谢产物的过程。前体：可被菌体直接并入次级代谢产物分子中，而自身结构没有明显改变。次级代谢中间体：进入次级代谢途径，被转化成一种或多种不同的物质，转化物经代谢才能形成次级代谢产物途径的终产物。如短链脂肪酸，异戊二烯单位，氨基酸等。分叉中间体：代谢中间体可以用来合成初级代谢产物，也可以用以合成次级代谢产物，这种中间体称为分叉中间体。例如：丙酮酸，乙酰辅酶A，草酰乙酸。98整理课件1.次级代谢产物合成的根本特征1〕次级代谢产物的合成具有种属特异性。相同菌种能产生不同结构的抗生素不同微生物也能产生同一抗生素2〕分批发酵时，在产物合成期大量合成次级代谢产物3〕次级代谢产物通常是结构相似的混合物。4〕次级代谢产物的合成受多基因控制。99整理课件2.次级代谢产物的生源聚酮体：含有多个羰基的聚合物。聚酮体的形成以起始单位为根底，与链的延伸单位不断缩合和脱羧，最终形成β－多酮次甲基链。糖类：以葡萄糖和戊糖为前体，形成次级代谢产物所需要的各种糖。包括氨基糖、糖胺、核糖、环多醇和氨基环多醇等。不常见氨基酸。非核酸的嘌呤碱和嘧啶碱。吩噁嗪酮利福霉素S甲羟戊酸100整理课件3.次级代谢产物生物合成的根本途径各种次级代谢产物以不同前体经过不同途径合成，再经化学修饰形成各种结构相似的生理活性物质。一般次级代谢产物合成的根本途径包括：前体聚合结构修饰不同组分的装配101整理课件前体聚合——不同生源、不同方式聚合在一起102整理课件103整理课件修饰——根本骨架上酶促反响104整理课件不同组分的装配——新生霉素对DNA盘旋酶有很好的抑制作用，对多种癌细胞有抑制作用，并能与抗癌药联合应用，逆转抗癌药的耐药性。105整理课件三〕次级代谢产物的主要调节机制1.初级代谢对次级代谢的调节

高柠檬酸合成酶三羧酸循环106整理课件2.碳代谢物的调节速效碳源阻遏次级代谢产物合成。3.氮代谢物的调节以蛋白质为氮源，可以促进次级代谢产物的合成，以无机氮为氮源抑制次级代谢产物的合成。4.磷酸盐的调节磷酸盐浓度超过10mmol/L，能抑制次级代谢产物的合成。107整理课件5.ATP的调节——影响次级代谢产物合成和糖代谢酶

6.诱导调节和产物的反响调节诱导调节——酶合成的诱导调节反响调节——添加分叉中间体7.细胞膜通透性调节8.金属离子和溶解氧的调节108整理课件tetracycline109整理课件四、发酵工艺条件确实定及主要控制参数110整理课件检测仪器和主要参数111整理课件生物学检测的主要参数和控制112整理课件113整理课件114整理课件3.发酵污染杂菌的检测和控制种子污染培养基灭菌不彻底，空气带菌设备及其附件渗漏115整理课件物理参数的检测与控制116整理课件对一种微生