微乳提取串联浊点浓缩分离姜黄中总姜黄素

微乳提取串联浊点浓缩分离姜黄中总姜黄素

姜黄是姜科植物的姜黄。它有辛、苦、性温、无权。对血液、气体和经络疼痛都有有效的治疗。姜黄提取物的主要成分为略带酸性的酚性物质,是姜黄素、去甲氧基姜黄素、二去甲氧基姜黄素的混合体,称之为总姜黄素。总姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗动脉粥样硬化、抗纤维化、抗诱变、抗癌、保肝、利胆等广泛药理活性〔2,3〕,是一种很有开发前景的天然化合物。总姜黄素的水溶性差,提取困难,目前研究从姜黄中提取姜黄色素的报道很多〔4-6〕,有碱水提取法、有机溶剂提取法、超声波提取法、超临界提取法、乳化剂协同法等,但都包含提取和精制两大步骤,较为复杂。因此本实验从微乳提取中药活性物质技术角度对姜黄中总姜黄素的提取工艺进行研究,用简单可行的方法,从姜黄中提取较大量的总姜黄素。1设备和材料1.1仪器、检测仪器752型紫外可见光分光光度计(上海霸宇恒平科学仪器有限公司);TD280-2B型台式离心机(上海安享科学仪器厂);KH-400KDB型高功率数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);粒度测定仪(Zetasizer1000HS,马尔文);高效液相色谱仪(Shimadzu公司产品):LC-10ATvp型泵,SPD-10Avp型紫外-可见检测器,CTO-10ASvp型柱温箱,CBM-20A型液相控制器,SIL-20A型自动进样器(Prominence公司);KromasilC18(250mm×4.6mm,5μm)。1.2试验用姜黄的药物姜黄素对照品(科密欧,质量分数>98%,批号:100501),去甲氧基姜黄素、二去甲氧基姜黄素对照品(自制,HPLC面积归一化法测得质量分数>98%)。试验用姜黄购于采芝林药店(产地:山西),经广东药学院生药教研室李钟副教授鉴定为姜科植物姜黄CurcumalongaL.的干燥根茎。油酸乙酯、无水乙醇、1,2-丙二醇、聚乙二醇-400、正丁醇均为分析纯;OP乳化剂、吐温-80、聚乙二醇辛基苯基醚、聚氧乙烯蓖麻油EL均为化学纯;葵花油、大豆油、花生油;乙腈(德国默克公司,色谱纯);超纯水(屈臣氏蒸馏水)。2方法和结果2.1标准曲线的绘制精密称取姜黄素对照品2.0mg及去甲氧基姜黄素、二去甲氧基姜黄素对照品各1.0mg,于25mL棕色量瓶中,加甲醇溶解、定容,摇匀。精密吸取该溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mL分别置10mL棕色量瓶中,加甲醇定容,摇匀,0.45μm微孔滤膜滤过,即得各浓度对照品溶液。采用HPLC法〔7〕,测定姜黄素、去甲氧基姜黄素和二去甲氧基姜黄素的含量,三者之和为总姜黄素的含量。以0.01moL/L磷酸二氢甲缓冲液-乙腈(50∶50,pH=2.5)为流动相,检测波长为425nm,流速为1.0mL/min,进样量为20μL,记录峰面积,重复测定3次,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。姜黄素、去甲氧基姜黄素、二去甲氧基姜黄素回归方程分别为:Y1=3.919×107C1-1.614×104,r1=0.9999;Y2=4.139×107C2-3.949×103,r2=0.9998;Y3=4.251×107C3-7.129×103,r3=0.9998。线性范围分别为0.00480~0.07680mg/mL、0.00258~0.04120mg/mL、0.00263~0.04200mg/mL。结果表明姜黄素、去甲氧基姜黄素、二去甲氧基姜黄素在相应的浓度范围内线性关系良好。2.3测定总姜黄素溶解量的方法确定表面活性剂的制备方法将过量的姜黄素分别加入大豆油、花生油、油酸乙酯和葵花油中,在功率为280W、温度为40℃的条件下超声30min,静置2h在3000r/min条件下离心5min;精密吸取上述样品的上清液10μL至100mL量瓶中,加75%乙醇定容,摇匀;精密量取各空白油相10μL至100mL量瓶中,加75%乙醇定容,摇匀,以此作为上述各样品所对应的空白溶液,在425nm处,UV法测定各样品的吸光度,每个样品测定3次取平均值,根据总姜黄素的标准曲线得出姜黄素的溶解量,选出溶解量最大的油相。以同样的方法选出溶解量最大的表面活性剂。结果见表1。2.4peg-400添加量的限制取OP乳化剂4g、油酸乙酯1.2g,混匀,加水至20mL,形成混浊不透明的乳剂,取1mL,滴加入无水乙醇、1,2-丙二醇和正丁醇后,溶液变的更浑浊,不能形成澄清透明的溶液;加入PEG-4000.628g后溶液变澄清(即加入量下限为0.628g),再加入0.513g后溶液变浑浊(即加入量上限为1.141g)。由此可见,该乳剂体系中PEG-400与所选的乳化剂和油相形成微乳的能力较强,所以选择PEG-400作为助乳化剂。2.5微乳液处理的优化2.6微孔滤膜的制备将1g姜黄药材用滤纸包封放进索氏提取器中,加入100mL无水乙醇进行提取,提取液定容至100mL,0.45μm微孔滤膜滤过。按“2.1”项下色谱条件进行分析,计算得出姜黄素、去甲氧基姜黄素和二去甲氧基姜黄素的质量分别为13.09、2.12、4.91mg,总姜黄素的质量为21.83mg。2.7dps提取参数的测定通过相关的实验证明姜黄中总姜黄素的提取量与超声提取时间、提取温度、提取功率和液料比密切相关,所以笔者利用DPS软件设计均匀试验方案,进行微乳提取姜黄中总姜黄素工艺的优化,试验方案见表2。精密称取姜黄药材1g,按表2进行试验,在相同条件下重复一次试验。精密吸取上清液0.1mL置于100mL量瓶中,加甲醇定容,摇匀,0.45μm微孔滤膜滤过,按照“2.1”项下色谱条件进行分析,分别测定出姜黄素、去甲氧基姜黄素、二去甲氧基姜黄素的峰面积,代入标准曲线中从而得出提取液中总姜黄素的含量,结果见表2。根据表2得出的均匀设计试验结果,利用DPS软件计算得出最优提取的回归方程为:Y=-14.9971241+0.556012X1+0.974159X2-0.047273X3-0.240978X4-0.002228X12-0.010138X22+0.000143X32+0.004071X42-0.005284X1X2-0.000507X1X3-0.001846X1X4-0.000073X2X3+0.002856X2X4+0.000399X3X4。最优提取工艺条件为:时间为12.5min,温度为52℃,功率为360W,液固比为40∶1,频率为40kHz;目标函数值即理论总姜黄素含量为16.8369mg。2.8固比和频率照“2.7”项下确定的最优条件,即时间为12.5min,温度为52℃,功率为360W,液固比为40∶1,频率为40kHz;进行3个批次姜黄的总姜黄素提取,结果微乳的总姜黄素平均提取量为20.12mg,超过了均匀设计试验的目标提取量,与索氏回流提取相比提取率达到了92.17%,RSD为0.3%,表明制备方法重现性良好,结果稳定、可靠。2.9油层总姜黄素量的测定取4mL离心后的姜黄提取液上清液,水浴加热使其油水分层,得到1.8mL油层和2.2mL水层,用“2.1”项下色谱条件分析总姜黄素的量,油层的总姜黄素量为1.75mg,水层的总姜黄素量为0.26mg,油层总姜黄素的萃取率达到86.85%。3提取工艺的可行性本实验确定微乳液处方为水∶油酸乙酯∶混合乳化剂=0.45∶0.1∶0.45;最优提取工艺为:时间为12.5min,温度为52℃,功率为360W,频率为400kHz,液固比为40∶1;总姜黄素的得率为92.17%,油层总姜黄素的回收率为86.85%。实验结果表明,微乳液对总姜黄素有较好的溶解度,提取效果理想,以微乳为桥梁,把提取工艺和分离工艺耦合到一起具有一定的可行性。利用微乳来提取难溶性中药,可避免有机溶剂的使用。同时根据微乳液的“浊点”来调控温度以实现目标成份的浓缩分离,进一步简化了提取分离工艺,达到快速浓缩的效果,降低药物的生产成本。在分离制备去甲氧基姜黄素、二去甲氧基姜黄素时发现高温下二者会部分转化为姜黄素,故在HPLC的含量测定中以三者之和计算总姜黄素来作为均匀设计实验的筛选指标。另外,微乳提取液和油层分离液可以不去除辅料直接引入下一步成型,例如制成微乳口服液、微乳固体片。姜黄素在体内口服生物利用度很低,如果将姜黄微乳提取物制成微乳剂型,利用其优良的特性,增加总姜黄素的溶解度,利于提高总姜黄素的生物利用度。2.2总姜黄素溶液的制备精密称取姜黄素对照品8.41mg于100mL量瓶中,用75%乙醇溶解、定容,制成0.0841mg/mL对照品溶液;精密吸取上述溶液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL,分别置于25mL量瓶中,加75%乙醇定容,摇匀,即为各浓度对照品溶液(UV法);取上述各浓度对照品溶液,以75%乙醇作为空白,在425nm处,UV法测定吸光度,每个样品测定3次,以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,得到回归方程:A=150.77C+0.0049,r=0.9999。结果表明,姜黄素在0.673~8.41μg/mL浓度范围内线性关系良好,2.5.1乳化剂和助乳化剂比例的选择:配制比例为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、3∶2、4∶3表面活性剂和助表面活性剂的混合乳剂,用蒸馏水稀释成20%的水溶液;各将过量的总姜黄素加入到上述溶液中,采用“2.2”项下方法进行样品的提取和处理。在425nm处,UV法测定吸光度,每个样品测定3次取平均值,根据总姜黄素的标准曲线得出姜黄素的溶解量,选出溶解量最大的混合乳剂。最终5∶1的混合乳剂溶解量为28.3mg/mL,在所有混合乳剂中溶解最大,因此确定乳化剂和助乳化剂的比例为5∶1。2.5.2微乳伪三相图的绘制:固定乳化剂和助乳化剂的质量比为5∶1,作为混合乳化剂。通过改变油相、水相和混合乳化剂的质量比,记录能形成澄清透明溶液并可见蓝色乳光的比例以此来绘制伪三相图,结果见图1。2.5.3最佳微乳处方的确定:在微乳区的四周以及中间各选取一个点,水相、油相和混合乳化剂的质量比分别为:0.55∶0.05∶0.4、0.5∶0.05∶4.5、0.35∶0.15∶0.5、0.48∶0.12∶0.4、0.45∶0.1∶0.45,按照上述比例分别配制微乳样品溶液,采用“2.3”项下方法进行样品的提取和处理。当水相、油相和混合乳化剂的质量比为0.45∶0.1∶0.45时所形成的微乳溶液对总姜黄素的溶解度最大,为79.10mg/mL,但该处方所形成的微乳溶液黏度比较大,不利于后续提取实验料液的分离,而由图1可知该体系所形成的微乳可以被水无限稀释,故对上述微乳溶液进行稀释,并比较微乳稀释液对总姜黄素的溶解度变化。经试验发现,上述微乳溶液被水稀释1倍时对总姜黄素的溶解度基本不变,且黏度变得较小,故确定最佳微乳处方为水相∶油相∶混合乳化剂=