Wilson病的分子流行病学、动物模型及临床特征指标的研究

Wilson病的分子流行病学、动物

模型及临床特征指标的研究Wilson病(Wilson’sdisease，WD)又称肝豆状核变性，是一种常染色体隐性遗传铜代谢障碍疾病铜在肝、脑、角膜等组织中沉积引起相应器官功能障碍，临床以肝硬化、锥体外系症状、角膜K-F环等为主要表现，严重者可危及生命Dr.KinnierWilson(1878–1937)ThefrontispiecetoWilson’soriginalarticleinBrain,1912.肝症状脑症状眼症状角膜K-F环铜生化检查血清铜蓝蛋白血清铜24h基础尿铜WD基因和蛋白

WD基因定位于13q14.3，全长约80kb，其cDNA编码一种分子量约165Kda由1465个氨基酸组成的P型铜转运ATP酶(ATP7Base)，WD基因又称ATP7B基因WD基因及其编码的ATP7B蛋白WD基因和蛋白

WD基因定位于13q14.3，全长约80kb，其cDNA编码一种分子量约165Kda由1465个氨基酸组成的P型铜转运ATP酶(ATP7Base)，WD基因又称ATP7B基因我单位杨任民教授所领导的科研团队自上世纪70年代始对WD的病因病理、发病机制、诊断分型、治疗与疗效评价等方面进行了深入、系统的研究，提出了一套较为完善的WD诊疗体系，采用中西医结合治疗WD患者获得显著疗效近来来，我单位在多项国家自然科学基金和安徽省科技厅、教育厅和卫生厅科研基金的资助下，尤其是在卫生部国家临床重点学科建设立项后，对WD的流行病学(分子流行病学)、动物模型和临床特征指标进行了相关研究流行病学调查主要是通过一定人群中进行调查、分析病例(或健康异常)的分布、变化及其规律，同时收集人群的健康状况、环境因素和社会因素，以探索其可能的致病因素WD的流行病学调查Scheinberg和Sternlieb(1984)推测不同人群WD的发病率为15～30/100万，患病率约1/3万，携带者频率约1/90，是大多数学者的认可并引用的结论

ScheinbergI,SternliebI.MajorProblInternMed,1984;23:1-24.WD的流行病学调查日本和韩国流行病学调查资料显示WD的患病率约为1.9～6.8/10万，杂合子约6.6/1000～13/1000SaitoT.JEpidemiolCommunityHealth,1981,35:274-280.SeoJK.KoreanJHepatol,2006,12(3):333-363.WD的流行病学调查长期以来人们认为WD属罕见疾病而未给予足够的重视，加之本病存在高度的临床和遗传异质性，在发病早期临床表现复杂多样，极易发生误诊和漏诊，严重影响本病的流行病学调查结果目前文献报道的资料多属非全面调查，其获得的WD患病率和发病率等流行病学资料，往往存在调查方案不够完整、样本量过少等问题，各家所得出的流行病学得出结果偏差较大，差异也较大。WD的流行病学调查我们于2008年11月～2010年6月间，根据年龄分层、整群一级、随机抽样的原则，由专业人员以裂隙灯检查双眼角膜K-F环作为筛查方法，对安徽省含山县、金寨县和利辛县7～75岁年龄组的汉族人群进行调查，以期获得较大样本的中国人WD流行病学资料WD的流行病学调查我们在上述3县中共调查了153370人，共发现9例WD确诊患者，其中含山县7例，金寨县2例；男性4例，女性5例9例患者中有4例为未发病的症状前期患者，另5例有临床症状的患者3例病程在1年以内，1例病程5年，另1例病程13年本组被调查人群WD患者的发病率约为1.96/10万，患病率约为5.87/10万，其患病率高于欧美国家，而与同位于东亚地区的日本、韩国等国家十分接近WD的流行病学调查WD的流行病学调查WD的流行病学调查WD的流行病学调查本研究的局限性：角膜K-F环检查虽见于大多数脑型WD患者，但在肝型患者中阳性率只有60%左右，无症状的亚临床型患者阳性率更低，因此存在有患者被遗漏的可能，其结果并不能真正反映实际的发病率和患病率采用各种高通量、高灵敏度的检测技术对更多地域人群进行更大样本量的WD流行病学调查是我们下一步的研究方向WD的流行病学调查WD的分子流行病学研究以2008年~2013年间在我院住院治疗的来自800个不同的家系1216例WD患者以及487位家系成员为研究对象，应用PCR-MassArray筛查ATP7B基因的突变，明确中国人WD患者的基因突变谱，分析中国人ATP7B基因的突变规律和特征，尝试探讨WD患者基因型和临床表型间的关系WD的分子流行病学研究SequenomMassARRAY检测平台(A)和WD的MassARRAY检测结果(B)WD的分子流行病学研究WD的分子流行病学研究WD的分子流行病学研究WD的分子流行病学研究WD的分子流行病学研究WD的分子流行病学研究Therewassignificantdifferenceinrespecttoageofonsetbetweenpatientswithhomozygousofp.Arg778Leu(N=152),heterozygousofp.Arg778Leu(N=487)andwithoutp.Arg778Leu(N=583).WD的分子流行病学研究Therewassignificantdifferenceinrespecttoserumceruloplasmin(Cp)level

betweenpatientswithhomozygousofp.Arg778Leu(N=152),heterozygousofp.Arg778Leu(N=487)andwithoutp.Arg778Leu(N=583).WD的分子流行病学研究TherewassignificantdifferenceinrespecttoBloodCopper(Cu)level

betweenpatientswithhomozygousofp.Arg778Leu(N=152),heterozygousofp.Arg778Leu(N=487)andwithoutp.Arg778Leu(N=583).WD的分子流行病学研究Therewassignificantdifferenceinrespecttoserumcopperoxidase(Sco)level

betweenpatientswithhomozygousofp.Arg778Leu(N=152),heterozygousofp.Arg778Leu(N=487)andwithoutp.Arg778Leu(N=583).WD的分子流行病学研究大样本的基因型与临床表型的研究结果提示p.Arg778Leu是对WD蛋白功能影响较大的突变基因型WD的动物模型WD模型的研究对了解其病因病机、寻找有效的治疗方法等具有重要意义。目前用于WD研究的模型有动物模型和离体细胞模型两大类，动物模型有铜负荷动物模型和铜代谢相关基因突变的遗传动物模型等。

WD的动物模型－大鼠铜负荷模型1999年，我们根据Friedman等(1994)报道的方法，采用喂饲含硫酸铜1g/kg的饲料和0.185%硫酸铜的饮水的方法建立了大鼠铜负荷模型，并用该模型观察了二巯丁二钠(DMS)的疗效进一步研究结果发现，铜负荷大鼠的基底节区、小脑、脑干、脊髓铜含量明显增高、血清和脑组织中Cu/Zn-SOD的活力降低、MDA升高，提示铜负荷可导致过量铜在脑组织中蓄积并通过降低Cu/Zn-SOD的活力使机体氧化应激水平增高，从而引起中枢神经细胞的损伤WD的动物模型－大鼠铜负荷模型我们还发现，铜负荷大鼠海马CA1区存在Aβ1-42蛋白和Tau蛋白的异常表达，而Aβ1-42的异常沉积和Tau蛋白的过度磷酸化是导致中枢神经系统变性疾病的重要发病机制WD的动物模型－大鼠铜负荷模型铜负荷大鼠模型的优点：易获得、重复性好及便于饲养等优点，且在最终的病理改变与WD具有一致性，为WD的发病机制和药物治疗学研究提供了一个良好的平台铜负荷大鼠模型的缺点：无法复制WD的遗传背景，不具有WD的铜代谢改变，不能模拟WD的发病过程，因此在该模型中得出的结论并不能完全适用于WDWD的动物模型－tx小鼠tx小鼠为DL小鼠所产生的自然突变品系，位于第8号染色体的Atp7b基因点突变所致其遗传背景(致病基因和突变类型)与WD相同，而且有着相似的病理和生化改变，是WD研究较为理想的动物模型我们于2012年从美国TheJacksonLaboratory引进tx小鼠(C3HeB/FeJ-Atp7btx-J/J

)，并成功进行传代繁殖以达到研究所需的种群数量WD的动物模型－tx小鼠殖和筛选TX小鼠200余只，满足了下一步研究的需要。WD的动物模型－tx小鼠殖和筛选TX小鼠200余只，满足了下一步研究的需要。tx小鼠种鼠及繁殖的乳鼠WD的动物模型－tx小鼠殖和筛选TX小鼠200余只，满足了下一步研究的需要。WD的动物模型－tx小鼠细胞内铜的转运通路WD的动物模型－tx小鼠CTR1在各组tx小鼠脑组织中的表达（IHC-P×400）A为模型组1月龄，B1、B2分别为模型组3月龄、模型组5月龄，C1、C2分别为肝豆汤治疗组3月龄、肝豆汤治疗组5月龄WD的动物模型－tx小鼠WD的动物模型－tx小鼠CTR1在各组tx小鼠肝组织中的表达（IHC-P×400）A为模型组1月龄，B1、B2分别为模型组3月龄、模型组5月龄，C1、C2分别为肝豆汤治疗组3月龄、肝豆汤治疗组5月龄WD的动物模型－tx小鼠WD的动物模型－tx小鼠ATOX1在各组tx小鼠脑组织中的表达（IHC-P×400）A为模型组1月龄，B1、B2分别为模型组3月龄、模型组5月龄，C1、C2分别为肝豆汤治疗组3月龄、肝豆汤治疗组5月龄WD的动物模型－tx小鼠WD的动物模型－tx小鼠ATOX1在各组tx小鼠肝组织中的表达（IHC-P×400）A为模型组1月龄，B1、B2分别为模型组3月龄、模型组5月龄，C1、C2分别为肝豆汤治疗组3月龄、肝豆汤治疗组5月龄WD的动物模型－tx小鼠WD的动物模型－tx小鼠CCS在各组tx小鼠脑组织中的表达（IHC-P×400）A为模型组1月龄，B1、B2分别为模型组3月龄、模型组5月龄，C1、C2分别为肝豆汤治疗组3月龄、肝豆汤治疗组5月龄WD的动物模型－tx小鼠WD的动物模型－tx小鼠CCS在各组tx小鼠肝组织中的表达（IHC-P×400）A为模型组1月龄，B1、B2分别为模型组3月龄、模型组5月龄，C1、C2分别为肝豆汤治疗组3月龄、肝豆汤治疗组5月龄WD的动物模型－tx小鼠WD的动物模型－tx小鼠中药肝豆汤对铜转运通路的调控WD的特征性临床指标WD的诊断主要依据阳性家族史、肝脏或/及脑损伤的典型症状体征、实验室铜生化检查的异常结果及角膜K-F环阳性等特征性临床指标虽然典型的WD患者根据以上指标不难诊断，但由于铜在不同脏器中沉积的速度和程度不同，很多WD患者并不具有上述的典型临床表现观察WD的各种临床指标在不同发病年龄、分型、病程的患者的敏感性和特异性，寻找WD患者的特征性临床指标285例WD患者铜生化检查结果WD的特征性临床指标-铜生化检查WD288例铜生化降低的WD患者各临床分型血清铜生化结果比较WD的特征性临床指标-铜生化检查假性硬化型WD患者的血清Cu水平明显高于脑内脏混合型、肝型和Wilson型，Wilson型WD患者血清SCO水平明显低于肝型及假性硬化型，CP水平明显低于肝型及脑内脏混合型WD患者血清铜生化诊断的ROC曲线分析WD的特征性临床指标-铜生化检查WD的特征性临床指标-血清肝酶谱分析比较WD患者与正常对照者血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、腺苷脱氨酶(ADA)、5‘-核苷酸酶(5’-NT)、总胆汁酸(TBA)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)和胆碱酯酶(CHE)的水平，结果发现WD患者血清中各项指标的水平分别与正常对照组相比ALT、AST、GGT、TBA、TBIL、DBIL和ADA水平显著高于正常对照者(P<0.01,P<0.05)，CHE水平显著低于正常对照组(P<0．01)，因此肝酶谱检测对WD患者肝脏功能损害的早发现具有重要意义WDWD检测131例首次住院的WD患者及63例健康对照者UA和胆红素，结果发现WD患者的血尿酸水平较健康对照组明显降低(＜0.01)，脑型、脑内脏型的患者较潜伏型、肝型明显减低，系统驱铜治疗的患者其UA水平与治疗前相比升高究其原因，UA是人体中一种的抗氧化剂，参与清除超氧化物、羟基以及单态氧等自由基以及螯合金属离子脑型、脑内脏型WD患者随病程时间越长，脏器损害加重，游离铜增多，自由基产生增多，需消耗更多的抗氧化物质系统驱铜治疗后的患者因体内铜的正平衡得以纠正，其体内游离铜和自由基水平减低，UA水平与治疗前相比升高WD的特征性临床指标-血尿酸(UA)分析检测WD患者和正常对照者尿常规和尿肾小管损害相关标志物［包括N-乙酰-D氨基葡萄糖苷酶(NAG)、视黄醇结合蛋白(RBP)、α1-微球蛋白(α1-MG)和β2-微球蛋白(β2-MG)］水平，结果发现196例WD有142例尿常规异常，WD组尿NAG、RBP、α1-MG和β2-MG水平显著高于正常对照组(P＜0.01,P<0.05)，而WD组各型间上述指标无差异；尿常规异常的WD患者尿NAG、RBP和α1-MG水平显著高于尿常规正常的患者(P＜0.01)，因此尿NAG、RBP和α1-MG水平是反映WD患者肾损害的敏感指标WD的特征性临床指标-肾损害相关标志物WD检测WD患者和正常对照者尿常规和尿肾小管损害相关标志物［包括N-乙酰-D氨基葡萄糖苷酶