结核分枝杆菌rd1基因编码抗原刺激后释放干扰素的细胞检测

结核分枝杆菌rd1基因编码抗原刺激后释放干扰素的细胞检测

淋巴结肿大是人类最常见的感染疾病之一。我国是结核感染高流行国家,早期准确诊断结核病对控制结核疫情至关重要。结核病的临床表现多样,可累及全身各器官系统,病变往往十分隐匿,然而现有的诊断方法如结核杆菌培养、抗酸染色、结核菌素皮试等敏感性和特异性有限。近年来,一种以结核分枝杆菌RD1基因编码抗原6kD早期分泌靶向抗原(earlysecretoryantigenictarget-6,ESAT-6)和10kD培养滤过蛋白(culturefiltrateprotein-10,CFP-10)肽段库为刺激原,应用酶联免疫斑点技术(enzyme-linkedimmunospotassay,ELISPOT)诊断结核感染的新方法逐渐兴起,新方法检测的是外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)中结核特异性T细胞γ干扰素的分泌,研究证实其具有高度的敏感性和特异性,且不受卡介苗接种及机体免疫状态的影响。基于抗原特异性T细胞向病变部位集中的特点,研究者在外周血检测的基础上开始尝试胸腹水、脑脊液中单个核细胞的ELISPOT检测,以期帮助诊断结核性胸膜炎、腹膜炎以及结核性脑膜炎。我国目前相关文献报道较少。本研究建立了通过检测胸腹水、脑脊液中释放γ干扰素的结核特异性T细胞诊断结核感染的方法,并通过与外周血结果比较,初步探讨检测胸腹水、脑脊液在诊断结核感染中的应用价值。elispot法检测外周血耐药基因表达对象选取北京协和医院2008年8月～2009年3月入院患者,疑似结核性胸膜炎2例、结核性腹膜炎2例、结核性脑膜炎5例,共9例。其中男性3例、女性6例;平均年龄(41.3±12.4)岁,均为人免疫缺陷病毒抗体检测阴性。制备胸腹水、脑脊液单个核细胞50ml高压灭菌离心管采集患者胸/腹水约20ml,500U肝素抗凝。4℃,相对离心力500×g离心7min,弃去上清,将管底细胞悬起,生理盐水洗涤,4℃,400×g离心5min,重复洗涤1次。用细胞培养基AIM-V将细胞悬起,计数后调整细胞悬液浓度至2.5×106/ml。15ml高压灭菌离心管采集患者脑脊液4ml,100U肝素抗凝,4℃,相对离心力400×g离心8min,弃去上清,将管底细胞悬起,生理盐水洗涤,4℃,400×g离心5min。用细胞培养基AIM-V重悬细胞,计数后将细胞悬液浓度调整至2.5×106/ml。分离外周血单个核细胞肝素抗凝管采集患者外周静脉血4ml,用生理盐水作1∶1稀释,缓慢加入内有4ml淋巴细胞分离液的15ml灭菌离心管中,使稀释血液重叠于分离液上。4℃,相对离心力900×g离心20min,取出悬浮于血浆和分离液间的PBMC层,生理盐水洗涤2次,4℃,400×g离心5min。用细胞培养基AIM-V重悬细胞,计数后将细胞悬液浓度调整至2.5×106/ml。ESAT-6、CFP-10肽段库ESAT-6肽段库包含17个肽段,CFP-10肽段库包含18个肽段,每个肽段均为连续的15个氨基酸残基,两端重叠10个氨基酸残基,这些肽段包含了抗原ESAT-6和CFP-10的所有氨基酸序列,经过质谱仪鉴定和高效液相层析纯化,纯度大于80%。并经GenBank数据库同源序列查询确认用于此项研究的肽段特定存在于结核分枝杆菌ESAT-6和CFP-10蛋白中。ELISPOT检测在已包被抗γ干扰素单抗的96孔板上,分别加入50μl细胞培养基作为空白对照,50μl植物血凝素作为阳性对照,50μl结核分枝杆菌特异性混合多肽ESAT-6和CFP-10作为刺激原。然后在每个孔中加入100μl上述细胞悬液,使反应体系中植物血凝素、ESAT-6肽段库、CFP-10肽段库终浓度分别为1μg/ml、10μg/ml、10μg/ml。把96孔板放在37℃孵箱培养16～20h后,用PBS液洗板4次,加入碱性磷酸酶标记的二抗,在2～8℃下孵育1h。孵育后再用PBS液洗板4次。最后每孔加入50μl显色底物液BCIP/NBTPLUS,室温中静置7min后去离子水终止反应。观察结果,并用ELISPOT分析仪(KSELISPOTVERSION4.9,ZEISS,Germany)进行斑点阅读与统计。空白对照孔内斑点数小于10且阳性对照孔内斑点数大于20时视为实验有效。当任一检测孔达到以下标准则判定为阳性结果:(1)如果空白对照孔斑点数<5个,检测孔斑点数减去空白对照孔斑点数≥6;(2)如果空白对照孔斑点数≥6个,检测孔斑点数必须>2倍的空白对照孔斑点数。统计学处理应用SPSS16.0进行统计学分析。t细胞干扰释放反应的合并和鉴定受试者基本情况及临床诊断9例患者中最终6例诊断为活动性结核,其中2例分枝杆菌培养阳性确诊,其余4例均由临床表现+影像学+实验室检测+抗结核治疗有效诊断,3例最终排除结核感染,分别诊断为门脉高压性腹水、乙肝后肝硬化(胸腔积液)、病毒性脑膜脑炎。受试者基本情况见表1。静脉血中RD1编码抗原刺激后T细胞γ干扰素释放反应9例患者中8例同时进行了静脉血ELISPOT检测,检测结果阳性6例、阴性2例。6例结果阳性的患者最终均被诊断为活动性结核。抗原ESAT-6刺激后斑点形成细胞数中位数为318/106PBMCs(4分位间距217～512);CFP-10刺激后斑点形成细胞数中位数为28/106PBMCs(4分位间距0～788)。2例ELISPOT检测结果阴性的患者最终均排除了结核感染。各例患者ESAT-6和CFP-10肽段库刺激后T细胞γ干扰素释放反应的合并结果见图1。胸腹水、脑脊液中RD1编码抗原刺激后T细胞γ干扰素释放反应胸腹水、脑脊液进行ELISPOT检测共9例,3例结果阳性的患者最终均诊断为活动性结核,结核性胸膜炎、腹膜炎、脑膜炎各1例。6例结果阴性的患者中,3例最终排除结核感染。3例ELISPOT检测结果呈阴性的结核性脑膜炎患者的脑脊液检测均在7～10日的4联抗结核治疗后进行。患者在ESAT-6和CFP-10肽段库刺激后T细胞γ干扰素释放反应的合并结果见图2。静脉血与胸腹水、脑脊液中T细胞γ干扰素释放反应结果比较8例患者同时进行了静脉血与胸腹水、脑脊液ELISPOT检测,5例结果一致,其中3例均诊断活动性结核,2例均排除结核。3例结核性脑膜炎患者检测脑脊液结果为阴性,但静脉血检测结果仍为阳性。与静脉血检测结果相比,脑脊液中斑点形成细胞数为564/106PBMCs,而外周血中为1152/106PBMCs,脑脊液中斑点形成细胞数少于静脉血;胸水中斑点形成细胞数为2196/106PBMCs,外周血中为344/106PBMCs;腹水中斑点形成细胞数为1276/106PBMCs,外周血中为40/106PBMCs,胸、腹水中斑点形成细胞数分别是外周血的6.4和31.9倍。elispot的诊断价值结核病累及部位广泛,临床表现多样,早期准确诊断困难。结核菌素皮试是目前应用最广泛的快速诊断结核感染的方法,但纯化蛋白衍生物是包含200多种蛋白成分的混合物,其中很多是非结核分枝杆菌及卡介苗(BacillusCalmette-Guérin,BCG)的共同抗原成分,因此在普遍接种卡介苗的地区,例如我国,存在非常高的“假阳性率”;而在肿瘤化疗患者、重度营养不良、艾滋病患者等免疫力低下的结核易感人群中敏感性下降,因此结核菌素皮试用于诊断结核并不理想。20世纪末,研究者们应用基因芯片技术将结核分枝杆菌标准株H37Rv和BCG的全基因组进行比较,发现了只特定存在于结核分枝杆菌而在BCG中缺失的区域,命名为RD1～RD16。其中RD1区被证实在所有的卡介苗菌株中均不存在,能够编码结核特异性抗原。本研究抗原ESAT-6和CFP-10均由RD1基因编码。ELISPOT技术是目前最敏感的检测抗原特异性T细胞的方法之一,可以检测出1/100000～1/50000PBMC中特异性抗原刺激后释放某种细胞因子的细胞,经过酶联显色形成斑点,通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数从而计算抗原特异性细胞的频率。将结核特异性抗原作为刺激原与ELISPOT技术相结合,就产生了诊断结核感染的免疫学新方法。现有研究绝大多数是以静脉血为检测物,计数特异性抗原刺激后分泌γ干扰素的PBMC。研究显示静脉血ELISPOT检测诊断结核感染的敏感性和特异性均在90%以上,而且不受BCG接种和机体免疫状态的影响。结核特异性的γ干扰素释放分析能为临床诊断提供参考,然而无法准确鉴别活动性结核与潜伏性结核感染。抗原特异性T细胞有向病变部位集中的特点,以胸水、腹水、脑脊液等为检测物的γ干扰素释放反应对诊断活动性结核如结核性胸腹膜炎、结核性脑膜炎更有意义。本研究9例患者进行胸腹水、脑脊液检测,其中8例同时进行了静脉血ELISPOT检测,检测结核分枝杆菌特异性RD1基因编码的抗原ESAT-6和CFP-10肽段库刺激后释放INF-γ的T细胞。结果显示静脉血与胸腹水、脑脊液检测具有较好的一致性。Wilkinson等于2005年首先进行了胸腹水中单个核细胞进行ELISPOT检测诊断结核病的研究,研究证实胸水和腹水中分泌γ干扰素的斑点形成细胞数是静脉血中的(15±6)倍,Losi等的研究也获得了相似的结果。本研究结果阳性的患者中,胸、腹水检测的斑点形成细胞数是静脉血的6.4和31.9倍,与文献报道一致。韩国Kim等首先研究了检测脑脊液中单个核细胞诊断结核病的敏感性,并与静脉血的结果进行比较,报道检测脑脊液和静脉血的敏感性分别为75%和91%。本研究外周血比脑脊液具有更高的阳性率和斑点形成细胞数,与Kim等的研究结果一致。此外,3例脑脊液检测结果阴性的结核性脑膜炎患者均经过1周以上的4联抗结核治疗。文献报道活动性结核患者在经过有效的抗结核治疗后,外周血中斑点形成细胞数出现下降趋势,提示本研究治疗有可能影响脑脊液检测结果,但尚无文献对抗结核治疗后脑脊液的斑点形成细胞数变化进行监测报道。与外周血单个核细胞ELISPOT检测相比,胸腹水、脑脊液ELISPOT检测可能