Cell Metabolism（IF=29）：川大揭示骨骼肌细胞外囊泡运输糖酵解酶介导肌肉与骨的串扰

CellMetabolism（IF=29）：四川大学团队发现细胞外囊泡在肌肉与骨串扰中的重要作用小高探究骨骼肌如何控制骨形成对于理解肌肉和骨骼之间的相互作用以及开发退行性骨病的治疗方法至关重要。2023年11月7日，四川大学廖立及田卫东共同通讯在CellMetabolism发表题为“Skeletalmuscle-derivedextracellularvesiclestransportglycolyticenzymestomediatemuscle-tobonecrosstalk”的文章，揭示骨骼肌来源的细胞外囊泡（Mu-EVs）运输糖酵解酶介导肌肉与骨的串扰。Mu-EVs经外周血到达骨骼进而被骨髓间充质干细胞（BMSCs）摄取，促进其成骨分化，对小鼠废用性骨质疏松症具有保护作用。01：骨骼肌分泌丰富的EV研究首先确定了培养的小鼠后肢肌肉组织上清含有丰富的EV。进一步将表达CD63的AAV载体（MHCK7-CD63-EGFP-AAV）局部注射到小鼠后肢的双侧骨骼肌中，从这些肌肉中分离出的Mu-EV有58%可被CD63-EGFP标记（图1A），EGFP+EV可以在血清中被检测到，且运动后血清中富集EGFP+EV高于运动前，这些结果表明骨骼肌在体内分泌的EV可以进入外周血中（图1B）。图1骨骼肌分泌丰富的EV（Mu-EV）02：Mu-EV进入骨骼组织并被BMSC吸收将MHCK7-CD63-EGFP-AAV载体局部注射到小鼠双侧后肢的骨骼肌中（图2A），发现小梁骨、皮质骨和生长板中的骨髓细胞亚群呈EGFP阳性，此外在皮质骨的微血管中也检测到荧光信号（图2B），表明Mu-EV可能通过血液循环直接转移到骨骼中。随后采用DiR标记的Mu-EV通过尾静脉注射到循环中，发现注射后1、6和24h在小鼠骨骼中检测到荧光信号，表明Mu-EV可以转运到骨组织中（图2C）。进一步将MHCK7-CD63-EGFP-AAV载体转染的骨骼肌与BMSC进行离体共培养，24h后在BMSC内观察到大量EGFP阳性颗粒（图2D）。结果表明由骨骼肌主动分泌的Mu-EV可以运输到骨骼并被BMSC吸收。图2Mu-EV进入骨骼并被BMSC吸收03：Mu-EV增强BMSCs成骨分化缓解废用性骨质疏松症采用茜素红S染色、碱性磷酸酶活性测定、成骨相关基因qPCR均证实Mu-EV促进BMSC成骨分化（图3A）。进一步构建了2种小鼠模型：1）跑步机运动来增加肌肉力量；2）局部注射A型肉毒杆菌神经毒素（BoNT/A）诱导肌营养不良。发现两种小鼠模型后肢分离的Mu-EV形态或颗粒大小无差异，Mu-EV颗粒数量在运动后增加，在肌营养不良后减少。此外，与普通Mu-EV相比，肌营养不良组Mu-EV促进BMSC成骨效果差（图3B），而运动小鼠Mu-EV促进BMSC成骨效果更好（图3C）。表明Mu-EV的分泌和生物活性与骨骼肌功能呈正相关。此外，通过尾静脉将正常的Mu-EV注射到肌肉萎缩小鼠模型，发现Mu-EV治疗改善BoNT/A诱导的废用性骨质疏松症，运动小鼠的Mu-EV效果更好（图3D）。图3Mu-EV增强BMSCs成骨分化缓解骨质疏松症04：蛋白质组学揭示骨骼肌EV包含糖酵解酶采用蛋白质组学方法检测正常小鼠和肌肉萎缩小鼠中分离出的Mu-EV，对39种在肌肉萎缩小鼠Mu-EV中的下调蛋白开展GO、KEGG分析，KEGG显示大约一半蛋白参与代谢通路（图4A），GO显示许多蛋白质与葡萄糖代谢相关途径有关（图4B）。进一步对正常小鼠和运动小鼠中分离出的Mu-EV进行蛋白质组学分析，上调蛋白的GO、KEGG分析显示出与上述研究结果一致（华盈生物为该研究提供了细胞外囊泡蛋白质组学技术服务）。结果表明骨骼肌将糖酵解酶分泌到Mu-EV中以调节受体组织/细胞中糖酵解相关反应。图4Mu-EV富含糖酵解酶05：体内/外实验揭示骨骼肌EV调节糖酵解促进成骨分化用鱼藤酮激活糖酵解增强BMSC成骨分化，而用2-DG抑制糖酵解减少成骨分化，Mu-EV和鱼藤酮对增强BMSC成骨分化具有协同作用，而抑制糖酵解会阻断Mu-EV对BMSC成骨分化的促进作用（图5A、5B）。2-DG处理完全阻断了运动对骨量的积极作用运动小鼠的Mu-EV的促成骨活性，此外，Mu-EV对肌肉萎缩小鼠的治疗作用被2-DG通过抑制糖酵解所抵消。结果表明Mu-EV在体内外主要通过增强糖酵解来促进骨形成（图5C、5D）。图5骨骼肌EV调节糖酵解促进成骨分化06：Mu-EV通过运输糖酵解酶LDHA诱导糖酵解前面的蛋白质组学结果显示PKM和LDHA是候选糖酵解酶，在正常Mu-EV中高表达，肌肉萎缩Mu-EV中表达减少。进一步发现运动小鼠Mu-EVs中的LDHA水平显著增加，而PKM水平保持不变，且Mu-EV治疗提高BMSC和骨组织中LDHA水平，而PKM水平保持不变。进一步siRNA敲低小鼠骨骼肌细胞系C2C12中的LDHA和PKM，发现敲低LDHA后的EV促进BMSC成骨能力较差，而敲低PKM无影响，结果表明LDHA是Mu-EV中激活BMSC糖酵解的候选蛋白。进一步利用AAV（AAV-shRNA-Ldha）在肌肉中特异性降低LDHA（图6A），发现接受AAV-sh-Ldha注射的小鼠的Mu-EV在促进葡萄糖消耗、乳酸产生以及BMSC中LDHA和成骨基因的表达方面效率较低（图6B、6C）。结果表明Mu-EVs主要通过运输糖酵解酶LDHA影响骨形成。图6Mu-EV通过运输糖酵解酶LDHA诱导糖酵解Mu-EV的作用机制模式图如下：图7研究作用机制模式图总结与讨论研究首先发现Mu-EVs的数量和生物活性与骨骼肌功能密切相关，随后通过蛋白质组学分析显示Mu-EVs中有许多蛋白质，其中一些可能调节骨代谢，特别是糖酵解酶。进一步实验证实Mu-EVs通过将LDHA输送到骨髓间充质干细胞中，促进了骨髓间充质干细胞的糖酵解。研究为治疗废用性骨质疏松症提供了一种有希望的方法。该案例为我们开展外泌体蛋白机制研究提供了很好的参考，不同细胞之间通过外泌体进行功能分子的传递，通过组学的方法，可以实现对外泌体中功能分子的检测。华盈生物是外泌体研究服务领域的领导品牌，拥有外泌体研究“一站式服务”体系，覆盖外泌体研究的方方面面，包括：外泌体的三项鉴定（电镜、WB、NTA）、外泌体蛋白组和修饰蛋白组筛选（Labelﾠfree、4D-DIA、PRM、MRM）、外泌体核酸筛选（miRNA、全转录组）、外泌体纳米流式检测、外泌体细胞&动物功能实验（荧光示踪）等。欢迎咨询400-869-2936微信同号）相关文献MaS,XingX,HuangH,etal.Skeletalmuscle-derivedextracellularvesiclestransportglycolyticenzymestomediatemuscle-to-bonecrosstalk.CellMetab.2023Nov7;35(11):2028-2043.e7.相关阅读1）Nature：癌症患者肝脏代谢功能絮乱的元凶被发现2）横跨20年，血浆外泌体miRNA预测肺功能变化轨迹3）高分案例分享｜肿瘤免疫研究的聚焦点——外泌体4）外泌体：预测肿瘤治疗反应的新型标志物5）BloodCancerDiscov封面文章：外泌体研究的创