百花山葡萄组培快繁体系的建立

百花山葡萄组培快繁体系的建立

百华山葡萄园是属于青霉科的葡萄园。与复叶葡萄很相像，其不同点在于本种叶通常呈鸟足状复叶，具细长小叶柄，小叶片菱形，基部楔形，中部以下呈深裂状，易于区别。除在小龙门狗槽子沟有分布外，在北京百花山的青枣架沟也有。百花山葡萄发现以后，得到了中国科学院植物研究所著名分类学家王文采院士的肯定。该种的发现对于丰富葡萄属的种质资源，具有重要价值。然而，在2005年，北京地区野外尚有两株存活；到了2009年，经北京野生植物普查，认定仅存一棵野生百花山葡萄，濒危灭绝的百花山葡萄亟待有效保护。目前，国内外对于葡萄再生体系建立工作已取得了较大的进展，E.Clog等、郎凤红、张美玲、陶建敏等分别利用葡萄的叶片、叶柄、单芽茎段等外植体，通过器官发生途径获得了再生植株；M.Luci等、G.Reustle等、Y.M.Zhu等、C.K.SALIUNKHE等分别利用葡萄的叶片、叶柄等外植体及原生质体，通过体胚发生途径获得了再生植株，快速建立无性繁殖体系，得到无病毒植株，进行种质资源的保存与交换，从而为遗传工程提供理想的受体材料。本研究对百花山葡萄组织培养快速繁殖技术进行初步研究，以培育高质量的百花山葡萄组培苗，使其种质资源得到保存与繁殖。1材料和方法1.1试验材料所用材料为植株当年生带芽茎段、嫩茎段及叶片，采自京西山区小龙门。仪器：Li-3000叶面积仪（美国Li-Cor)1.2.1消毒外植体污染率=污染数/接种数（1)成活率=成活数/接种数（2)1.2.3苗木生根率的测定1)1/2WPM（大量元素减半）；2)1/2WPM（大量元素减半）+IBA0.2mg·L-1;当丛生芽1～2cm高，具2～4片小叶时，将其从基部分开，将无菌小芽接种生根培养基上诱导生根。每处理接种10瓶，每瓶接种3个小芽，重复3次，定期观察记录，30d后统计计算芽苗生根率。生根率（%）=诱导生根的数量×100/接种数量（4)光照强度40～60μmol·m-2·s-1，光照时间10h·d-1，温度（25±2）℃。待生根苗40d，根须旺盛，植株高长到7cm左右，茎杆粗壮，叶片舒展、叶色翠绿时，从培养室取出培养瓶，在温室中放置2d后，打开瓶盖，向培养瓶内注入灭菌水，水层1cm左右，置于50%遮阳网下，静置7d。用50cm×20cm×8cm的育苗盘，分别装入3种基质：河沙、蛭石、1︰1混合的珍珠岩︰草炭，每种基质装4盘，共计12盘。用0.3%高锰酸钾消毒后备用。将25℃左右的洁净温水注入炼苗瓶，轻轻摇晃，以镊子取出试管苗，放入装有25℃洁净温水的水盆中，清洗，换水2次，直至根部清洗干净为止。在准备好的育苗盘中开深度为4cm左右的小沟，成排植入百花山葡萄组培苗，轻轻覆盖、压实，每盘50株，总共600株。充分喷淋至水从育苗盘底部渗出。保持温室内25℃，80%以上相对湿度的小环境，每天适时适量浇水。2结果与分析2.1消毒时间的确定10%的H2O2消毒液的消毒效果不及15%的H2O2消毒液，污染率高，成活率低。随着消毒时间的增加，污染率呈下降的趋势，可能是因为过长的消毒时间导致了外植体杀菌过度而死亡。15%的H2O2消毒液消毒4min既保证了低的污染率，成活率也相对比较高（表1），因此，15%H2O2消毒4min为百花山葡萄外植体的适宜消毒方法。2.2和9号培养基的诱导率外植体接入5d左右叶柄开始膨大，10d左右开始进行分化，20d左右形成愈伤组织，但愈伤组织色泽、松散程度不一。统计结果显示（表2),6、8和9号的诱导率都达到了100%，诱导出的愈伤组织为淡绿色、透明且质地紧密，说明6、8和9号培养基适合百花山葡萄愈伤组织的诱导。1号培养基上未诱导出愈伤组织；2、3、4号培养基愈伤组织的诱导率不高，所诱导出的愈伤组织质地松软，在一段时间后褐化明显乃至死亡。可见，MS+0.6mg·L-16-BA+0.3mg·L-1NAA为适宜于百花山葡萄愈伤组织诱导的培养基。2.3丛生芽的诱导繁殖百花山葡萄的丛生芽的诱导，以低浓度激素较佳，6-BA1.0mg·L-1,NAA0.1mg·L-1为宜（表3）。2.4/2wpm不加激素培养基以小组对植株生长和生长的影响诱导培养30d后，当不定芽高7～9cm时，将其转接到生根培养基中。在1/2WPM加IBA的培养基30d时，不定芽颜色嫩绿，分株丛数较多，最多值达7枝，叶片较大，叶裂明显，且小芽数量多；经40d后，植株生长颜色翠绿，长势良好，主茎较粗壮，约为1.0～1.2mm，叶片伸展，叶片有效光合作用面积大，根系发达，主根粗壮，呈奶白色至浅黄色，须根繁多。1/2WPM不加任何激素培养基上，30d时植株生长状态良好，叶色及株高和分株较少。从表4可分析得，当IBA的质量浓度在0.0～0.4mg·L-1之间时可诱导出不定根，但不添加IBA时，诱导出的不定根数量最少，平均3.82条，且平均长度14.00cm。在IBA的质量浓度为0.4mg·L-1时不定根数量和平均长度达到最多，分别为5.49条，平均长度18.39cm，但也存在极值，最多的可达16条不定根，直径在0.02～1.10mm，根颜色多为白色至乳黄色且粗壮。从表5可看出，2号培养基培养时，每株平均叶面积达到最大，叶色翠绿，光泽度高，叶面舒展，叶片光合作用效果更好。3号培养基的分株丛数多，单叶片面积较小，叶片数量多，部分叶片有畸形现象，卷曲或褶皱较深。2.5成活率情况以珍珠岩+草炭作为百花山葡萄移栽的基质，百花山葡萄的成活率最高，达到了93.5%（表6）。说明使用珍珠岩和草炭以1∶1的比例混合均匀的复合培养基，并保持温室内温度25℃，相对湿度80%适宜百花山葡萄移栽的成活。3营造人工4个月内的自然适应网络不同的激素及激素浓度直接影响着愈伤组织的诱导率、状态和质地。植物的回归（再引种）是基于迁地保护的基础上，通过人工繁殖把植物引入到其原来分布的自然或半自然的生境中，以建立具有足够的遗传资源来适应进化改变、可自然维持和更新的新种群。植物回归研究方法都是对这些濒危物种通过迁地保护后，获得一定数量的个体，然后才有可能实施回归。因此，对于繁殖材料匮乏的极小种群来说，植物组织培养不失为一条有效途径。对于百花山葡萄的回归，应该是在其原生环境引入人工繁育个体后，注意采集人工种群的种子，然后分别进行试管培养，以扩大其遗传基础，使之能够适应变化的环境。本研究建立了百花山葡萄的快速繁殖体系，确定了百花山葡萄外植体最佳消毒条件，利用正交试验确定百花山葡萄的丛生芽诱导培养基。为脱毒、品种改良，以及抗病性研究、生理生化特性研究和百花山葡萄的野外重引入等研究奠定了基础。1.2愈伤诱导培养基的制备取健康的外植体，充分水洗后用流水冲洗30min。在超净工作台上用75%乙醇消毒30s，取出后用无菌水冲洗3～4次，再分别用10%、15%H2O2溶液浸泡3min、4min、5min，取出后用无菌水冲洗5～6次。接种时，叶片剪去叶缘，沿主脉剪成0.5cm2的小片；嫩茎去掉两头及带腋芽部分，切成0.5cm长的小段，接种到不同的愈伤诱导培养基上。观察外植体的污染、成活情况，以筛选适宜消毒方法。1.2.2外植体生长状况测定以MS培养基为基本培养基，添加不同浓度6-BA和NAA的9个组合作为愈伤组织诱导培养基，每处理接种30瓶，每瓶3块外植体。接种后7d记录生长状况。诱导愈伤组织率=诱导出愈伤组织的数量/接种后未被污染的外植体数（3)以1/2MS培养基（大量元素减半）为基本培养基，添加不同浓度6-BA和NAA作为丛生芽的诱导培养基，2因素3水平正交试验，每瓶接种3块愈伤组织，每处理接种30瓶，接种后35