艾草复合杀菌活性及稳定性研究

艾草复合杀菌活性及稳定性研究

大多数食品生产室和无机室的空气消毒使用亚硝酸盐和化学剂进行短期喷雾剂，并在无人的情况下进行。天然植物精油或中药提取物制剂除了杀菌消毒作用外,相比化学消毒剂还具有许多特殊的功能和优点。艾草(Artemisiaargyi)为菊科蒿属,味苦,微温、无毒。其成分含挥发油0.02%。艾草燃烟消毒已有报道,但由于烟熏时有较大的烟雾,对人体有一定的影响。本课题组以水为提取剂进行回流提取,浓缩所得浸膏状物对G+、G-有较好的抑菌效果。我国每年大量加工和消费柑桔的同时也产生数量惊人的桔皮(占果实质量的20%~25%)。桔皮中富含橙皮甙、桔皮素等多种生物活性成分,而实际利用率甚为低下,多被弃用。日本学者曾利用柑桔皮干燥粉碎,用醇提法制成了具有良好抗霉效果的饲料防霉剂。谭周进等人利用有机溶剂提取柑桔提取物对霉菌、酵母菌显示了较好的抑菌效果。空气中主要有附着于从地面飞起的球菌属(包括葡萄球菌属在内的兼性厌氧菌)、形成孢子的好氧性杆菌(如枯草芽孢杆菌)、色串孢属等野生酵母、青霉等霉菌的孢子等。本文利用艾草及柑桔提取物,进行协同抑菌效果的研究,为艾草空气清新消毒剂的研制奠定理论基础。1材料和方法1.1实验材料和设备1.1.1实验原材料1.1.2供试菌种的选择青霉(Penicilliumsp.)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusarueus)、假丝酵母(Candiasp.):广东特色调味品工程技术开发中心,供试菌种依据空气中常见代表菌来选择。1.1.3培养基和试剂营养琼脂培养基(NA),孟加拉红培养基(虎红琼脂),平板计数琼脂培养基(PCA),乙醇。1.1.4热电、蒸汽消毒器XS-10B500克多功能粉碎机;DNP-9162型电热恒温培养箱;YXI-1型电子数显电热恒温水浴锅;YX-280型手提式蒸汽消毒器;GG500型电子天平;蒸馏装置及其他实验室常规设备。1.2方法1.2.1原料的制备1.2.1.水浴回流浸提液制备将适量干艾草放于高速粉碎机中粉碎均匀,以水为溶剂,按料液比为1:10称取适量艾草粉末与水于500mL圆底烧瓶中,连接好蒸馏装置,在温度为60℃条件下进行水浴回流浸提3h。浸提完毕,冷却过滤,取滤液。真空浓缩,挥干得到艾草浸提物,为确保乙醇控制在无杀菌作用的前提下,用40%的乙醇做溶剂制成3mg/mL浓度的溶液,保存备用。1.2.1.犯罪人员中乙醇的提取取烘干的桔皮放于高速粉碎机中粉碎均匀,置于圆底烧瓶中,加入浓度为95%乙醇100mL,在60℃下保温3h,冷至室温,抽滤,滤液在50℃下真空浓缩回收乙醇,用石油醚反复洗涤、离心分离、真空浓缩,得到桔皮浸提物,为确保乙醇控制在无杀菌作用的前提下,用40%的乙醇做溶剂制成5mg/mL浓度的溶液,保存备用。1.2.2试验菌液1.2.2.1.细菌细菌液与酵母菌菌液的制备取活化的菌种斜面,用无菌生理盐水制成菌浓度为108~109cfu/mL菌悬液,备用。1.2.2.2.悬挂真菌悬浮液1.2.3中和实验实验菌按照《消毒技术规范》(卫生部2002版)规定的方法分组、操作与判断实验结果。1.2.4小圆滤纸片的贴片将已灭菌的小圆滤纸片(D=5mm)浸于复合物溶液中,制成样品滤纸片,用无菌移液器取0.2mL的指示菌悬液分别涂布相应培养平皿中,在每个平板贴3片相同成分的小圆滤纸片;再将上述贴好的滤纸的含菌平板倒置放入培养箱中,培养取出观察测量抑菌圈的大小。1.2.5综合组成1.2.5.复配体系稳定性试验保持2组份复合物的总质量(150mg)不变,选择艾草及桔皮提取物不同体积进行配比,最后将复合物总体积定容至5mL,以保证复合物总质量浓度一致(见表1),分别取枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、青霉、金黄色葡萄球菌、酵母菌菌液1mL和不同配比复合物1mL,作用10min后再分别加中和剂5mL,作用后取菌液稀释液0.1mL接种于相应培养基中培养计数。原始菌液做对照,计算杀菌率(%)。1.2.5.枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、青霉菌液培养取1.2.5.1最适质量浓度配比复合物5、1、0.5mL,定容至5mL,分别取1mL加入装有1mL枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、青霉菌液试管(各5支)中,5、10、15、20、25min后再分别加中和剂5mL,作用后取枯草芽孢杆菌、大肠杆菌菌液稀释液0.1mL接种于PCA培养基37℃培养24h,取青霉菌液稀释液0.1mL接种于孟加拉红培养基28℃培养72h。原始菌液做对照,计算杀菌率(%)。1.2.6抗菌效果稳定实验1.2.6.抑菌圈大小的测定用最佳配比的复合物浓度进行实验,取5mL溶液置于4个10mL试管中,分别置于40、60、80、100℃,热处理15min后,对照样为未加热溶液(20℃),以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、青霉为指示菌,进行抑菌实验,计算抑菌圈大小。1.2.6.抑菌圈大小测定用最佳配比的复合物浓度进行实验,取原始混合液,用不同pH值的缓冲溶液稀释,使其混合液pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、青霉为指示菌,进行抑菌实验,计算抑菌圈大小。1.2.6.紫外照射法用最佳配比的复合物浓度进行实验,分别吸取5mL于6支灭菌试管中,置于紫外灯下照0、2、4、6、8、10min。以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、青霉为指示菌,进行抑菌实验,计算抑菌圈大小。2结果与分析2.1缓冲溶液可终止实验原液对实验菌的残留作用结果表明:1%大豆卵磷脂,3%吐温80、1%硫代硫酸钠的磷酸盐缓冲溶液可有效终止实验原液对实验菌残留作用。具有良好的中和效果,且中和剂及其中和产物对实验菌及培养物均无不良影响。2.2真菌的抑菌效果由表2可以看出:艾草提取物对实验细菌的生长均有抑制作用,尤其对大肠杆菌(革兰阴性杆菌),但对真菌抑菌效果不明显;而桔皮提取物对实验细菌的生长抑制作用效果较差,但对真菌有明显的抑菌效果,尤其是霉菌。当艾草提取物与桔皮提取物按第7组的质量配比时,复合物对细菌、真菌的生长综合抑制力最强,因此本实验将第7组配比定为最佳配比:2mL艾草提取物(3mg/mL)+1.8mL桔皮提取物(5mg/mL),定容至5mL。该制剂黄绿色、澄清、气味芳香。空气中主要存在的微生物包括细菌(G+、G-)、真菌(霉菌、酵母),利用艾草、桔皮提取物进行有效复合配比,能对空气杀菌有协同杀菌效果。2.3艾草复合消毒对指示菌的杀菌效果的影响将2mL艾草提取物(3mg/mL)+1.8mL桔皮提取物(5mg/mL),定容至5mL的复合物溶液,稀释5倍、10倍,分别取1mL加入装有1mL枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、青霉菌液试管中,研究完全杀灭时间。结果见表3。由表3可知:不同艾草复合消毒剂不同稀释浓度对指示菌有杀菌作用。浓度越高,杀菌时间越短。其中原液和1:5都在15min内能将指示菌杀灭完全。考虑成本,选取原液稀释5倍作为复合消毒剂配方:复合提取物浓度为3mg/mL,其中艾草提取物浓度为1.2mg/mL,桔皮提取物浓度为1.8mg/mL。2.4热稳定性下降由图1可知:艾草复合消毒剂经热处理15min后,超过60℃,热稳定性明显下降。而在60℃以下,仍具有很强的杀菌能力,与未经高温处理的样品对比,3种指示菌实验结果均无明显变化,有利于艾草复合物作为空气消毒剂,方便保存与使用。2.5物ph范围对杀菌效果的影响在常温下,当pH≤4时,由于酸性过高,大肠杆菌、枯草芽孢杆菌无法生长。由图2可知,艾草复合物pH范围在6~8范围内对G+(枯草芽孢杆菌)、G-(大肠杆菌)、真菌(青霉菌)综合杀菌效果较大,峰值明显。当pH为8时,复合物对青霉菌的抑菌效果最好(12.0mm),当pH为7时,复合物对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的抑菌效果最好,抑菌圈直径分别为11.4、10.8mm。2.6氮菌株对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的抑制作用由图3可知,复合物对紫外线很敏感。照射6min后对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌无抑制作用。照射8min后,对青霉菌无抑制作用。可能与艾草、桔皮提取物具有环状结构有关。3艾草复合消毒经配比实验及完全杀菌实验,最佳复合消毒剂配比为:复合提取物浓度为3mg/mL,其中艾草提取物浓度为1.2mg/mL,桔皮提取物浓度为1.8mg/mL。艾草复合消毒剂经60℃