rp-hplcesi-ms法测定锁阳提取物中原花青素

rp-hplcesi-ms法测定锁阳提取物中原花青素

中药锁阳是医学科的一种干燥的肉质茎药物。该药物分布在中国西北部的沙漠地区。这是多年生和多年生植物，通过白牙科的根连接到腹部。内蒙古、宁夏、甘肃、青海为其主要产地。锁阳中的原花青素(procyanidins)在锁阳的药用机理中起到重要作用。原花青素是一种鞣质,是迄今为止所发现的最有效的自由基清除剂之一,其结构很复杂,主要由(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素、(-)-表儿茶素没食子酸酯及其二聚、三聚、四聚体组成,其基本组成单位是黄烷-3-醇和黄烷-3,4-二醇。由于原花青素聚合度、单体及连接键的不同,因此,分离及结构表征比较困难。目前研究最多的是葡萄籽中原花青素的提取、分离和结构的研究,而对锁阳中原花青素的研究未见报道。目前原花青素的分离鉴定方法有:①纸色谱(PC);②薄层色谱法(TLC);③毛细管电泳分离鉴定原花青素(CE);④高效液相色谱法分析鉴定(HPLC)。HPLC方法包括RP-HPLC(反相-HPLC)和NP-HPLC(正相-HPLC)。RP-HPLC最为常用。在RP-HPLC分析鉴定原花青素用时,常用的检测器有:①UV检测(UltravioletDetection);②ED检测(ElectrochemicalDetection);③FLD分析检测(FluorescenceDetecto);④MS检测(Massspectroscopy)。其中MS可以提供各化合物的结构信息,特别是与HPLC的联用,为原花青素的在线分析及检测提供了强有力的武器。电喷雾质谱(ESI-MS)是一种大气压电离技术,易于与液相色谱联用。这种软离子化技术,产生准分子离子,其优点是碎片少,可以直接根据产生的分子离子进行定性。尤其适用于多酚类物质的检测。Fulcrand等用RP-HPLC/ESI-MS技术对葡萄酒中的低聚原花青素进行了成功的分析。本实验采用RP-HPLC/ESI-MS技术对锁阳中原花青素进行分析是一种简便适用、行之有效的分析方法。1实验部分1.1化学试剂及药材甲酸、石油醚(30～60℃)、乙酸乙酯均为AR,国药集团化学试剂有限公司;甲醇,国药集团化学试剂有限公司;GC重蒸水。内蒙古产道地药材:中药锁阳,70%乙醇;WATERSSYNAPTQTFMS液质联用仪(包括色谱仪:WATERSACQUITYUPLC检测器:WATERSACQUITYPDA)。1.2提取渣的制备将中药锁阳40℃温度下,在烘箱中烘干后粉碎。准确称取2.0g锁阳干燥粉末于烧杯中,加入石油醚脱脂后抽虑,所得粉末40℃下烘干,然后加入70%乙醇40mL,调节提取液pH至5,室温下避光超声提取20min。过滤后,残渣再用70%乙醇20mL超声提取10min。过滤并合并滤液。旋转蒸发浓缩到25mL,经过0.45μm滤膜过滤后,待RP-HPLC/ESI-MS分析。色谱条件:分析柱BEHC-182.1×50mm1.7μm,流动相A1%甲酸,流动相B80%甲醇-1%甲酸。梯度洗脱0～5min,100%A;5～20min,100%A→20%+80%B,流速0.3mL/min。柱温30℃,检测波长200～500nm,进样量1μL。质谱条件:离子方式ESI-ESI+;毛细管电压3kV;锥孔电压30V;离子源温度(SourceBlockTemp)100℃;脱溶剂气温度250℃;质量范围100～2000m/z光电倍增器电压650V;气流量600L/h。2原花青素单体和二聚体的质谱特性原花青素单体相对分子质量为290,主要由(+)-儿茶素和(-)-表儿茶素组成,广泛存在于葡萄籽、山楂等多种植物中。原花青素单体还包括(-)-表儿茶素没食子酸单酯,其相对分子质量为442,这些单体相应的准分子离子[M-H]m/z分别为:289,289,441。各单体通过C4-C6或C4-C8键相连,形成二聚体、三聚体、四聚体……。根据聚合体相应的相对分子质量,得到准分子离子(ES-)[M-H]m/z:577(二聚体),729(二聚体单酯),881(二聚体二酯),865(三聚体),1153(四聚体)……。该实验通过负离子为选择离子检测锁阳原花青素低聚体,由于锁阳提取液中成分复杂,杂质含量较高,干扰较大,并且原花青素是通过黄酮类物质中的黄烷醇聚合而成,原花青素的各聚合体之间极性相近,该次实验采用的液相色谱条件只能较好地分离原花青素单体和二聚体、三聚体少数几种。原花青素结构见图1,单体选择性离子色谱图及3.40min和3.71min保留时间下的质谱图见图2、图3。由图2、图3可以看出,单体的选择离子只检测出负离子m/z289,经标准品对照,确定分别为(+)-儿茶素和(-)-表儿茶准分子离子。并未检测出(-)-表儿茶素没食子酸单酯(m/z441),且2种单体分别在4.70min和5.55min出峰。据文献报道(+)-儿茶素比(-)-表儿茶先出峰,所以可以推出(+)-儿茶素在4.70min处出峰,(-)-表儿茶在5.55min出峰。二聚体选择性离子色谱图及二聚体的ESI负离子质谱图见图4、图5。图4和图5中,从准分子离子峰m/z577选择离子色谱图和各峰的ESI-质谱信息可以看出,二聚体有6种,分别在4.60、5.07、5.76、6.74、7.29、10.32min处出峰。m/z577峰的ESI负离子质谱图不仅显示了准分子离子信息,还提供了某些碎片的信息。原花青素聚合体的碎裂方式主要包括黄烷醇间连接键的断裂和retro-diels-alder(RAD)反应。黄烷醇C-环上发生RAD反应,失去一个相对分子质量为152的中性的结构(C8H8O3)。经RAD重排产生的碎片离子为m/z425.质谱图中的m/z425证明了这一点,并和Wollgast等研究巧克力原花青素结果相一致。黄酮类分子中的母核很容易失去CO(m/z28),m/z549.2就是由二聚体失去一个CO得结果。黄烷醇间断裂有2种可能,一种是失去仅以C4键与其他单元相连的顶部单元T-unit(TOP)中性碎片,形成m/z为[m/z288-H]的离子;另一种可能是失去以C6或C8键与其他单元相连的底部单元B-unit(BASE),形成m/z为[m/z290-H]的碎片片断。m/z289.1为二聚体失去T-unit(TOP)形成的碎片。选择性离子色谱峰未检测出m/z729和m/z881的没食子酸二聚体单酯和没食子酸二聚体二酯的质谱信息,锁阳中不存在没食子酸二聚体单酯和没食子酸二聚体二酯。三聚体选择性离子色谱图及三聚体ESI负离子质谱图见图6、图7。从图6三聚体选择性离子色谱图我们可以看到,三聚体的异构体数目显著增加,且由于杂质的干扰,分析分离三聚体难度进一步提高。仅能从色谱图中检测到保留时间为5.65、5.96、6.44、7.29、7.46min几种含量较高的三聚体。从图7三聚体的ESI负离子质谱图分析:m/z865.2为其准分子离子峰,其断裂可能之一是失去1个T-unit,形成m/z577.2二聚体负离子碎片。色谱图未发现m/z1017三聚体单酯选择性离子峰。由此也说明不存在酯型聚合体。3聚合度对原花青素提取效果的影响该实验通过采用RP-HPLC/ESI